Reakcia fixácie komplementu(RSK) je komplexná dvojstupňová sérologická reakcia. Používa päť zložiek, ktoré tvoria dva systémy: antigén, protilátka, komplement (prvý systém); ovčie erytrocyty senzibilizované (ošetrené) hemolytickým sérom obsahujúcim protilátky pre ne špecifické (druhý, čiže indikátorový, hemový systém). V tomto prípade vedie interakcia protilátky s antigénom v prvom štádiu reakcie k vytvoreniu imunitného komplexu, ktorý adsorbuje komplement, čo sa však nedá vizuálne zistiť. V druhom štádiu sa hemový systém používa ako indikátor väzby komplementu na komplex antigén-protilátka, ktorý ako imunitný komplex je tiež schopný ho adsorbovať. V konečnom dôsledku existujú dva možné výsledky reakcie. Ak si protilátka a antigén navzájom zodpovedajú a komplement je adsorbovaný vytvoreným komplexom, nedôjde k lýze erytrocytov hemového systému. Ak sa protilátka nezhoduje s antigénom a naopak, komplement, ktorý zostane voľný, sa pripojí k hemovému systému a spôsobí hemolýzu.

Podobne ako iné sérologické testy, aj RSK možno použiť na detekciu špecifických protilátok proti známemu antigénu alebo na detekciu antigénu proti známym protilátkam.

všeobecné charakteristiky ingrediencie RSC.

1. ŠTUDIJNÉ SÉRUM pred nastavením sa reakcia zahrieva vo vodnom kúpeli 30 minút, aby sa inaktivoval vlastný komplement, a riedi sa od 1:5.

2. ANTIGÉNOM môžu byť kultúry baktérií, ich lyzáty, vírusy a materiály obsahujúce vírusy, extrakty patologicky zmenených orgánov a tkanivové lipidy.

3. DOPLNK - sérum z morčiat získané v deň pokusu. V súčasnosti sa používa priemyselný suchý komplement.

4. HEMOLYTICKÝ SYSTÉM pozostáva z hemolytického séra zmiešaného v rovnakých objemoch a 3% suspenzie ovčích erytrocytov v sedimente. Na senzibilizáciu erytrocytov hemolyzínmi sa zmes udržiava v termostate pri teplote 37 °C počas 30 minút.

Vyhlásenie o hlavnom experimente RSC. SÉRO, ANTIGÉN A KOMPlement sa pridajú do 1 skúmavky, do tretej skúmavky sa pridá sérum, komplement a izotonický roztok chloridu sodného namiesto antigénu (SERUM CONTROL), antigén, komplement a rovnaký roztok chloridu sodného (ANTIGEN CONTROL). Skúmavky sa umiestnia do termostatu pri teplote 37 °C na 1 hodinu. Zároveň sa pripraví hemolytický systém, ktorý sa po vybratí stojana z termostatu pridá do všetkých troch skúmaviek. Po zmiešaní systému hemu so zložkami troch skúmaviek sa tieto skúmavky opäť umiestnia na 1 hodinu do termostatu a po uplynutí tejto doby sa zoberú do úvahy výsledky RSC.

Pri zohľadnení RSC je intenzita reakcie označená plusmi: "++++" - ostro pozitívna reakcia s úplným oneskorením hemolýzy je kvapalina v skúmavke bezfarebná, všetky erytrocyty sa usadili na dne; "+++", "++" - pozitívna reakcia, charakterizovaná zvýšením farby kvapaliny v dôsledku hemolýzy a znížením počtu erytrocytov v sedimente; "+" - slabo pozitívna reakcia, kvapalina je intenzívne sfarbená, na dne skúmavky je malé množstvo červených krviniek. Negatívna reakcia je označená znakom "-", zatiaľ čo sa pozoruje úplná hemolýza, kvapalina v skúmavke má intenzívnu ružovú farbu ("laková krv").

RSK je veľmi zložitá, ale veľmi citlivá špecifická reakcia. Široko používaný pri diagnostike syfilisu, chronická forma kvapavka, čierny kašeľ, aktinomykóza, všetky rickettsiózy a vírusové infekcie.

Prepojený imunosorbentový test.

Metódu vyvinuli na začiatku 70. rokov nezávisle tri skupiny vedcov. Metóda sa podobá RIA, ale je založená na značení Ag alebo Ab, ktoré vstupujú do reakcie s enzýmom. Vzd značky so substrátom je zvyčajne sprevádzaná zmenou farby média. V súčasnosti boli vytvorené početné modifikácie tejto metódy, ale najpoužívanejšia je heterogénna ELISA na pevnej fáze (solid-phase). Rozlíšiť:

1) PRIAMA ELISA V TUHEJ FÁZE. V tomto prípade:

1. Sérum s Ab sa inkubuje s Ag fixovaným na pevnom substráte (najčastejšie je to plastová mikroplatnička).

2. Ab neviazané Ag sa odstráni opakovaným premytím.

3. K Ag naviazanému na Ab sa pridá sérum označené enzýmom.

4. Určite počet markerového enzýmu naviazaného na At.

2) KONKURENČNÁ ELISA NA PEVNEJ FÁZE.

1. Pridá sa sérum. Ak obsahuje špecifické Ab, potom sa viažu na Ag fixované na pevnom substráte. Ak neexistujú žiadne špecifické Ab, potom Ag nie je viazaný.

2. Pri pridávaní Protilátok špecifických pre fixované Ag v prvom prípade nebudú mať s čím interagovať (väčšina Ag je už naviazaná) Þ obsah markera je nízky. V druhom prípade sa špecifické Ab naviažu na Ag a pri umývaní sa neodplavia Þ vysoký obsah markera.

Podobne možno. PROTILÁTKY sú fixné a rôzne spoločnosti vyrábajú presne tablety s už fixným At.

V porovnaní s klasické metódy detekcia antigénov, táto metóda umožňuje priamo zaregistrovať ich interakciu s protilátkami, a nie sekundárne prejavy (aglutinácia, precipitácia alebo hemolýza). Metóda je veľmi CITLIVÁ (stačí koncentrácia 1ng/ml).

Určte: Chlamýdie, klostrídie, HIV atď.

8. Reakcia fagocytózy.

Fagocytózu vykonávajú mikrofágy a makrofágy. Štádiá fagocytózy: priblíženie, lepenie, ponorenie, trávenie.

Hodnotenie funkčnej aktivity fagocytárnych buniek.

Množstvo fagocytárna aktivita granulocytov a monocytov sa hodnotí v plnej krvi, v suspenzii leukocytov alebo v obohatených frakciách fagocytujúcich buniek. Ako štandardné objekty fagocytózy sa používajú monodisperzné latexové častice s priemerom 1,0-2,0 μm, suspenzia teplom usmrtených baktérií alebo kvasiniek.

Fagocyty sa zmiešajú s fagocytovaným materiálom v pomere 1:10 alebo 1:100 a inkubujú sa pri 37 °C počas 30 minút za stáleho miešania. Skúmavky sa potom odstredia a peleta sa resuspenduje v kvapke krvného séra, aby sa pripravil náter. V náteroch fixovaných May-Chryunwaldovým farbením a farbených podľa Romanovského-Giemsa sa vypočíta percento fagocytujúcich buniek (FP - fagocytárny index) a počet absorbovaných častíc na 1 bunku (PF - fagocytové číslo).

O zdravý človek FP = 40-80 %, PF = 1-5.

9. Diagnostika.

Diagnosticum je suspenzia určitých mikrobiálnych buniek usmrtených zahrievaním alebo formalínom so známym obsahom buniek na jednotku objemu. Ako antigén možno použiť aj suspenzie živých baktérií. Reakčný jav sa objaví vopred po dvoch hodinách (pri 37 0 C), konečný výsledok sa berie do úvahy pri teplote miestnosti po 18-20 hodinách. Pre diagnostiku je pozitívna reakcia zaujímavá len pre určitý titer v sére, ktorý slúži ako diagnostický. Takže pri brucelóze je diagnostický titer 1:200 a pri tula-rémii -1:100. Na detekciu protilátok sa môžu uskutočniť expresné aglutinačné reakcie (čas zúčtovania je niekoľko minút). Napríklad: 1. Reakcia kvapiek krvi pri tularémii. Do kvapky plnej krvi pacienta na špeciálnom pohári sa aplikuje kvapka destilovanej vody (na hemolýzu) a kvapka tularemia diagnosticum. Reakcia nastáva v priebehu 1-2 minút, aglutináty sú jasne viditeľné vo forme belavých hrudiek. 2. Na skle na brucelózu sa vykoná expresná aglutinačná reakcia podľa Heddelsona.

Tieto reakcie neumožňujú určiť množstvo protilátok v sére b) identifikovať čistú kultúru patogénov infekčných chorôb. Na tento účel imunodiagnostika

aglutinačné séra produkované vakcínami a sérovými ústavmi imunizáciou zvierat celými mikrobiálnymi bunkami. Pre spoľahlivosť je lepšie používať adsorbované séra, aby obsahovali len protilátky, ktoré zodpovedajú určitému typu alebo typu mikroorganizmu.

Princípy získavania imunitných sér.

Imunitné sérum (antisérum) je krvné sérum obsahujúce protilátky proti danému antigénu. Vo väčšine prípadov sa imunitné (diagnostické) séra na mikrobiálne, tkanivové a iné antigény získavajú experimentálne imunizáciou zvierat vhodnými antigénmi.

Medzi hlavné požiadavky na antiséra patrí ich vysoká špecifickosť a dostatočný obsah protilátok. Podľa špecifickosti sa rozlišujú polyvalentné (polyšpecifické) a monovalentné (monošpecifické) antiséra. Polyvalentné séra obsahujú protilátky proti mnohým antigénom, monošpecifické - na jeden konkrétny antigén. Môžete získať monošpecifické séra:

1) použitie vysoko purifikovaných antigénov na imunizáciu zvierat,

2) odstránenie natívnych sér od protilátok s nežiaducou špecifickosťou.

Na toto použitie:

1) imunoafinitná metóda, ktorá je založená na väzbe protilátok určitej špecifickosti na zodpovedajúce antigény imobilizované na nosiči na pevnej fáze s následnou separáciou vzniknutých AG-AT komplexov a izoláciou protilátok;

2) metóda adsorpcie podľa Castellaniho. Na tento účel mikroorganizmy obsahujúce všetky skupinové antigény, čím adsorbuje homológne anti-

telo. Takéto adsorbované monošpecifické antiséra obsahujú protilátky proti rôznym determinantom molekuly antigénu, ktoré sú heterogénne v triede (podtriede)

Reakcia fixácie komplementu (RCC) spočíva v tom, že pri vzájomnej korešpondencii antigénov a protilátok vytvoria imunitný komplex, ku ktorému je prostredníctvom Fc fragmentu protilátok pripojený komplement (C), t.j. komplement je viazaný antigénom- komplex protilátok. Ak sa nevytvorí komplex antigén-protilátka, komplement zostáva voľný.

Špecifická interakcia AG a AT je sprevádzaná adsorpciou (väzbou) komplementu. Keďže proces fixácie komplementu nie je viditeľný vizuálne, J. Bordet a O. Zhangu navrhli použiť hemolytický systém (ovčie erytrocyty + hemolytické sérum) ako indikátor, ktorý ukazuje, či je komplement fixovaný komplexom AG-AT. Ak si AG a AT navzájom zodpovedajú, teda vznikol imunitný komplex, potom sa komplement naviaže na tento komplex a nedochádza k hemolýze. Ak AT nezodpovedá AG, potom sa komplex nevytvorí a komplement, ktorý zostane voľný, sa spojí s druhým systémom a spôsobí hemolýzu.

Priebeh reakcie

Reakcia prebieha v dvoch fázach zahŕňajúcich dva systémy; bakteriálne a hemolytické. Prvá reakcia (špecifická) zahŕňa antigén 4-+ protilátka + komplement. Pozitívny výsledok reakcie, ku ktorej dochádza, keď protilátky zodpovedajú antigénu, je charakterizovaný tvorbou špecifického komplexu bakteriálny antigén-protilátka s adsorbovaným, alebo, ako sa hovorí, „viazaným“ komplementom. Zostávajúci neviditeľný, komplex nespôsobuje žiadne vonkajšie zmeny prostredia, v ktorom vznikla. Negatívny výsledok CSC nastáva, keď neexistuje žiadna špecifická afinita medzi antigénom a sérovou protilátkou a je charakterizovaný retenciou voľného aktívneho komplementu. Prvá fáza RSK sa môže vykonávať v termostate pri 37°C (1-2 hodiny) alebo v chladničke pri 3-4°C (18-20 hodín). Pri dlhšej tvorbe imunitného komplexu antigén-protilátka v chlade dochádza k úplnejšej väzbe komplementu a v dôsledku toho sa zvyšuje citlivosť reakcie. Pri nastavovaní porovnávacích pokusov sovietskeho imunológa akad. V. I. Ioffe a jeho študenti ukázali, že v podmienkach dlhodobej fixácie komplementu v chlade možno zachytiť 100-500-krát menšie množstvá antigénu a získať pozitívne výsledky pri vysokých riedeniach imunitného séra ako v experimente s fixáciou komplementu pri teplote 37 ° C v priebehu 1-2 hodín Druhá fáza reakcie (indikátor) prebieha medzi činidlami hemolytického systému (zmes 3% suspenzie erytrocytov a hemolytického séra v rovnakých objemoch) pri teplote 37 ° C iba v prítomnosti komplementu, ktorý zostáva voľný z prvej fázy reakcie (negatívna reakcia). Pri nedostatku voľného aktívneho komplementu nedochádza k hemolýze erytrocytov pôsobením špecifických hemolyzínov (reakcia je pozitívna).

Komponenty

Komplement fixačný test (RCC) je komplexný sérologický test. Na jeho realizáciu je potrebných 5 zložiek, a to: AG, AT a komplement (prvý systém), ovčie erytrocyty a hemolytické sérum (druhý systém).

Antigénom pre CSC môžu byť kultúry rôznych usmrtených mikroorganizmov, ich lyzáty, zložky baktérií, patologicky zmenené a normálne orgány, tkanivové lipidy, vírusy a materiály obsahujúce vírusy.

Ako doplnok sa používa čerstvá alebo suchá srvátka. morské prasa.

reakčný mechanizmus

RSK sa uskutočňuje v dvoch fázach: 1. fáza - inkubácia zmesi obsahujúcej tri zložky antigén + protilátka + komplement; 2. fáza (indikátor) - detekcia voľného komplementu v zmesi pridaním hemolytického systému pozostávajúceho z ovčích erytrocytov a hemolytického séra obsahujúceho protilátky proti nim. V 1. fáze reakcie pri tvorbe komplexu antigén-protilátka dochádza k väzbe komplementu a následne v 2. fáze nedôjde k hemolýze erytrocytov senzibilizovaných protilátkami; reakcia je pozitívna. Ak sa antigén a protilátka nezhodujú (v testovanej vzorke nie je antigén alebo protilátka), komplement zostáva voľný a v 2. fáze sa spojí s komplexom erytrocyt-antierytrocytová protilátka, čo spôsobí hemolýzu; reakcia je negatívna.

Aplikácia

Fixáciu komplementu možno použiť na:
1) detekcia špecifických protilátok v neznámom sére na základe ich interakcie s antigénom známej povahy;
2) štúdium vlastností antigénu v reakcii so známym špecifickým sérom. Príprava ingrediencií na nastavenie RSK.

1. Krvné sérum získané pre štúdiu, v predvečer nastavenia reakcie, sa zahrieva vo vodnom kúpeli pri 56 °C počas 30 minút, aby sa inaktivoval jeho vlastný komplement. Inaktivované sérum možno skladovať pri teplote 3-4°C počas 5-6 dní. V deň experimentu sa sérum zriedi izotonickým roztokom chloridu sodného v pomere 1:5 (0,1 ml testovacieho séra + 0,4 ml izotonického roztoku chloridu sodného).

2. Antigénom pre staging RSK môžu byť kultúry rôznych mikróbov, bakteriálne proteíny a extrakty získané z mikrobiálnych kultúr, patologicky zmenených a normálnych orgánov a tkanív. Vlastnosti prípravy antigénu sú určené povahou infekčný proces a charakteristiky jeho pôvodcu.

3. Komplement je zmes séra získaná od 3-5 zdravých morčiat, alebo suchý komplement v ampulkách.

Bezprostredne pred použitím sa sérum morčiat zriedi izotonickým roztokom chloridu átria v pomere 1:10, čím sa získa zásobný roztok.

4. Hemolytické sérum sa inaktivuje zahrievaním na teplotu 56 °C počas 30 minút pred nastavením experimentu. Trojtitrové hemolytické sérum sa používa na stanovenie základných skúseností s RSK, ako aj na titráciu komplementu a antigénu. Napríklad, ak je titer hemolytického séra 1:1800, v reakcii sa použije riedenie séra 1:600.

5. Erytrocyty sa získavajú z defibrinovanej ovčej krvi. Krv na odstránenie fibrínových filmov sa filtruje cez trojvrstvový gázový filter. Výsledný filtrát sa odstredí, sérum sa odsaje a scedí a erytrocyty sa premyjú 3-4 krát odstredením izotopickým roztokom chloridu sodného. Pri poslednom premytí erytrocytov by mala byť vrstva tekutiny nad usadeninou úplne priehľadná. Z premytých erytrocytov sa pripraví 3 % suspenzia v izotonickom roztoku chloridu sodného. Po príprave zložiek zahrnutých v CSC vyššie uvedeným spôsobom začnú titrovať hemolytické sérum, komplement a antigén.



hemolytická reakcia.

Hemolytická reakcia (RG) - Ide o deštrukciu červených krviniek pôsobením protilátok za účasti komplementu.

RG komponenty.

1. Antigén- 3% suspenzia erytrocytov v izotonickom roztoku chloridu sodného;

2. Protilátka - hemolytické sérum- sérum obsahujúce protilátky proti erytrocytom (hemolyzíny); sérum sa získava imunizáciou králikov baraními erytrocytmi;

3. Doplniť- systém krvných bielkovín, ktoré sa adsorbujú na komplexe antigén-protilátka a vytvárajú komplex napádajúci membránu, ktorý ničí antigén, t.j. ničí erytrocyty alebo inak spôsobuje lýzu erytrocytov ( hemolýza). Ako doplnok čerstvo pripravené krvné sérum morčiat.

Ak sa erytrocyty, hemolytické sérum a komplement umiestnia do skúmavky v určitých množstvách, potom v priebehu niekoľkých minút dôjde k deštrukcii (hemolýze) erytrocytov, v dôsledku čoho sa tmavočervená zmes zmení na ružovú ("laková krv") .

Reakcia hemolýzy sa používa ako indikátor pri nastavovaní reakcie fixácie komplementu.

Komplement fixačný test (CFR) je komplexná sérologická reakcia zahŕňajúca 2 systémy antigén-protilátka a komplement. 1. systém - špecifické, 2. - hemolytický systém.

Túto reakciu vyvinuli J. Bordet a O. Zhangu, ktorí zistili, že počas tvorby komplexu antigén-protilátka sa na tento komplex viaže komplement. Viditeľný efekt kde neviditeľný teda na detekciu väzby komplementu (a následne na detekciu tvorby komplexu antigén-protilátka, keď si navzájom zodpovedajú), t.j. ako indikátor používa sa 2. - hemolytický systém.

RSK sa častejšie používa na sérodiagnostiku (zisťovanie protilátok proti pôvodcovi ochorenia v krvnom sére pacienta ) kvapavka, syfilis, čierny kašeľ, týfus a iné rickettsiózy a mnohé vírusové ochorenia. RSK sa používa aj na séroidentifikáciu.

komponenty RSK.

1. Antigén- extrakty mikróbov, haptény, menej často - suspenzia mikróbov, t.j. antigén môže byť buď korpuskulárny (nerozpustný) alebo molekulárny (rozpustný).

2 . Protilátka- krvné sérum chorého človeka (na sérodiagnostiku) alebo imunitné diagnostické sérum obsahujúce známe protilátky (na séroidentifikáciu).

3. Ovčie erytrocyty – antigény hemolytická reakcia.

4. Hemolytické sérum- sérum obsahujúce protilátky na ovčie erytrocyty. Sérum prijímať imunizáciou králika baraními erytrocytmi.

5. Doplniť– čerstvo pripravené sérum z morčiat (tekuté alebo lyofilizované).

6. Elektrolyt- izotonický roztok chloridu sodného.

Nastavenie RSK.

Pred nastavením experimentu sa titruje antigén, pacientovo sérum, hemolytické sérum a komplement (stanoví sa ich titer). Sérum pacienta sa zahrieva na 56 °C počas 30 minút.

RSC sa vykonáva v 2 fáza.

I fáza - špecifické: v jednej skúmavke sa pripraví špecifický systém - zmiešajú sa rovnaké množstvá známeho antigénu, pacientovho séra a komplementu, v ďalšej skúmavke sa pripraví hemolytický systém - zmes ovčích erytrocytov a hemolytického séra, skúmavky sa umiestnia do termostat na 37 °C po dobu 30 minút. Zároveň sa pripravia kontroly na antigén, komplement a hemosystém, kontrolné vzorky so sérom známeho chorého (pozitívne sérum) a známeho zdravého človeka (negatívne sérum) a tiež sa umiestnia na 30 minút do termostatu.

II fáza - indikátor: rovnaké množstvo hemolytického systému sa pridá k počiatočnej zmesi a do všetkých kontrolných skúmaviek a výsledky reakcie sa vezmú do úvahy po 30 minútach ponechania v termostate.

Účtovanie výsledkov RSC s dokonalými výsledkami v kontrolách .

pozitívna reakcia(človek je chorý a jeho sérum obsahuje zodpovedajúce protilátky proti pôvodcovi ochorenia - antigénu): v I. fáze sa v špecifickom systéme vytvárajú komplexy antigén-protilátka, na ktoré sa viaže komplement, po pridaní hemolytického systému vo fáze II, hemolýza nie je pozorovaná, pretože komplement je naviazaný na 1. špecifický systém. Viditeľný efekt- vzdelanie sediment erytrocytov.

Negatívna reakcia(človek je zdravý a v jeho sére nie sú protilátky proti pôvodcovi ochorenia): netvoria sa komplexy antigén-protilátka a komplement v I. fáze zostáva voľný; antierytrocytové protilátky) a spôsobuje hemolýzu erytrocytov. Viditeľný efekt hemolýza erytrocytov „laková krv“.

Pri diagnostike infekčných chorôb sa používajú aj neutralizačná reakcia (RN) toxínu s antitoxickým sérom, imunofluorescenčná reakcia (RIF), rádioimunoanalýza (RIA), enzýmová imunoanalýza (ELISA).

IN Reakcia je založená na dvoch javoch - bakteriolýze a hemolýze. Na ich prejave sa podieľa komplement. Preto sa v RSC používajú dva systémy komponentov: 1) poskytuje fenomén bakteriolýzy a používa sa na diagnostické účely; 2) hemolytické, indikátorové, pomocné; umožňuje určiť, či sa doplnok viazal alebo neviazal v prvom systéme (pozri farebnú schému na obr. I). Predtým sa ako antigén používala suspenzia baktérií, preto sa prvý systém nazýval bakteriolytický (v pozitívnych prípadoch došlo k lýze baktérií).

Nastavenie RSC sa vykonáva v dvoch fázach. V prvej fáze sa pripraví bakteriolytický systém: 0,5 ml testovacieho séra sa zmieša s antigénom v skúmavkách, pridá sa komplement v presne definovanej dávke (titra). Zmes antigén - sérum-komplement (bakteriolytický systém) sa udržiava vo vodnom kúpeli (alebo termostate) počas 20 ... 40 minút pri teplote 37 ... 38 "C. Výsledok interakcie zložiek v skúmavke je neviditeľný, kvapalina zostáva priehľadná a bezfarebná.Na stanovenie, kontaktovaný Ak je komplement v bakteriolytickom systéme, uskutoční sa druhý stupeň reakcie: do skúmaviek sa pridajú zložky hemolytického systému – premyté ovčie erytrocyty a inaktivované hemolytické sérum, ako je znázornené v schéme. Všetky zložky bakteriolytického systému sa pretrepávajú, aby sa zmiešali v skúmavke, umiestnia sa do vodného kúpeľa s teplotou 37...38 °C na 20...40 min. Potom sa pridajú zložky gemologického systému, všetko sa druhýkrát pretrepe a opäť sa umiestni do vodného kúpeľa na 10–15 minút.

Predbežný výsledok. Ak je sérum získané z chorého zvieraťa, potom obsahuje protilátky, ktoré sa kombinujú so špecifickým antigénom. Na tento komplex (antigén - protilátka) sa viaže komplement - nedochádza k hemolýze, výsledok je pozitívny.

V sére zdravého zvieraťa nie sú žiadne protilátky: komplex antigén-protilátka sa netvorí, komplement v bakteriologickom systéme sa neviaže. Po pridaní erytrocytov a hemolyzínu (ide o antigén a protilátku) komplement reaguje s týmto komplexom - dôjde k hemolýze, výsledok je negatívny (viď farba obr. II).

Záverečný účet výsledku. Skúmavky sa nechajú pri izbovej teplote 15...20 hodín Ak bolo sérum v bakteriolytickom systéme z chorého zvieraťa, v skúmavke sa vytvorí špecifický komplex antigén-protilátka, ktorý adsorbuje (viaže) všetok pridaný komplement. V dôsledku toho v druhom, hemolytickom, hemolytickom systéme nenastane, erytrocyty sa usadia na dne skúmavky, supernatant je priehľadný. Výsledok RSC je pozitívny.

Ak neexistujú žiadne špecifické protilátky proti antigénu použitému v testovacom sére (v prípadoch, keď je sérum zo zdravého zvieraťa), komplex antigén-protilátka sa v bakteriolytickom systéme nevytvára, a preto komplement v tomto systéme nie je adsorbovaný, ale zostáva voľný. Pri pridávaní zložiek hemolytického systému (v druhej fáze reakcie) dochádza k interakcii komplementu s druhým komplexom (hemolyzín - erytrocyty), dochádza k hemolýze erytrocytov - nevytvára sa zrazenina, kvapalina v skúmavke je lakovočervená . Výsledok RSK je negatívny.

RSK. použitie: 1) na zistenie špecifických protilátok v sére chorého zvieraťa (pri diagnostike brucelózy, peripneumónie, sopľavky, leptospirózy, trypanozomiázy a pod.); 2) na detekciu špecifického antigénu (bakteriálneho alebo vírusového) v testovanom materiáli v prítomnosti špecifického imunitného séra.

Na nastavenie RSK musíte mať: vzorky séra prijaté na výskum; dve séra, známe pozitívne (štandardné, poskytujúce pozitívny výsledok) a dve normálne séra. Všetky séra v riedení 1:10 sa inaktivujú pri 56...58 °C počas 30 minút; antigén v riedení podľa titra; komplement zriedený v súlade so stanoveným titrom počas titrácie v bakteriolytickom systéme; hemolyzín v pracovnom titri; baranie erytrocyty (I: 40); fyziologický roztok, odmerné pipety, skúmavky, stojany, vodný kúpeľ pri 37...38 °C.

Pred stagingom RSK sa ovčia krv defibrinuje, erytrocyty sa premyjú fyziologický roztok centrifugáciou až do úplnej priehľadnosti supernatantu, ktorý sa odstráni odsatím a vyzrážané erytrocyty sa zriedia vo fyziologickom roztoku 1:40 (2,5 %). Antigén sa zriedi podľa titra uvedeného na štítku biofabrikou. Hemolyzín a komplement sa titrujú pred nastavením RSK.

Antigén pre CSC sa pripravuje v biofabrikách. Zvyčajne ide o extrakty zničených mikrobiálnych suspenzií (alebo tkanív obsahujúcich vírus). Antigény by nemali mať hemolytický účinok, ktorý je kontrolovaný počas reakcie (1 ... 2 dávky antigénu a 0,5 ml suspenzie erytrocytov sa nalejú do skúmavky: nesmie dôjsť k hemolýze). Na ampulke s antigénom je v biofabrike uvedené, že je určená pre RSK (sapny, brucelóza alebo iné). Na obale je uvedené číslo šarže, dátum výroby, dátum spotreby, aktivita antigénu, to znamená, v akom riedení sa má použiť pri nastavovaní RSK (1:100, 1:150 atď.). Pri niektorých ochoreniach slúžia ako antigény iné materiály; napríklad na diagnostiku peripneumónie veľkého dobytka antigén pre CSC je lymfa teľaťa experimentálne infikovaného subkutánne alebo intrapleurálne. Pri dlhodobom skladovaní antigénov sa ich titer opäť kontroluje v laboratóriu podľa špeciálnej titračnej schémy.

Testované séra prijaté na štúdiu sa zriedia fyziologickým roztokom 1: 5 alebo 1: 10, inaktivujú sa zahrievaním vo vodnom kúpeli, aby sa zničil ich vlastný komplement počas 30 minút pri 56 ... 58 "C (séra somárov, mulov, mulíc - pri 61 °C).

Hemolyzín sa pripravuje v biofabrikách hyperimunizáciou králikov premytými erytrocytmi barana. Za týmto účelom sa králikom intravenózne injikuje 4...5 krát v 2...3-dňových intervaloch 40...50% suspenzia erytrocytov. Týždeň po poslednej injekcii sa králikom odoberie krv, sérum sa sterilne odsaje, inaktivuje, konzervuje glycerolom 1:1 alebo 0,5% fenolom, titruje, naleje do ampuliek. V laboratóriách sa pred nastavením RSK znova titrujú.

Schéma titrácie hemolyzínu. Pripravte: i) riedenie doplnku 1:20; 2) hemolyzín 1:100 (0,2 ml hemolyzínu + 9,8 ml fyziologického roztoku); 3) suspenzia ovčích erytrocytov 1:40; 4) fyziologický roztok NaCl.

Na nastavenie titračnej reakcie sa dva rady skúmaviek umiestnia do stojana - jeden pomocný len na prípravu riedenia hemolyzínu, druhý - na samotnú titráciu. Počiatočné riedenie hemolyzínu 1:100 sa pridá do prvej skúmavky každého radu a potom sa uskutoční sériové riedenie. Všetky skúmavky sa pretrepú a umiestnia do vodného kúpeľa s teplotou 37...38 °C na 10...15 minút. Započítanie výsledku: v tomto príklade najmenšie množstvo (alebo jeho najvyššie riedenie), ktoré spôsobilo úplnú hemolýzu, je 1:2000, t.j. toto je jeho skutočný titer. Pracovný titer je 2-krát koncentrovanejší - 1:1000.

0,5 ml (označené šípkami) každého riedenia zo skúmaviek prvého radu sa prenesie do samostatných skúmaviek druhého radu. Pridajte 0,5 ml komplementu (1:20), 0,5 ml baraních erytrocytov (2,5% suspenzia alebo 1:40) a 1 ml fyziologického roztoku do všetkých skúmaviek v druhom rade tak, aby objem tekutiny v každej liekovke bol 2,5 ml.

Poznámka. Na základe skutočnosti, že na konečnej formulácii RSC sa bude podieľať 5 zložiek po 0,5 ml, čo bude tvoriť objem 2,5 ml, je tento objem dodržaný počas celej práce.

Skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa do vodného kúpeľa na 10-15 minút. Hemolýza bude primárne prebiehať v skúmavkách s vysokým obsahom hemolyzínu (jeho najmenšie riedenie je 1:500, 1:1000 ...). Najmenšie množstvo hemolyzínu (jeho najvyššie zriedenie), ktoré za týchto podmienok spôsobilo úplnú hemolýzu erytrocytov, je tzv. limitujúci (skutočný) titer hemolyzín. Na ďalšiu prácu sa používa hemolyzín 2-krát koncentrovanejší, teda v dvojnásobnom množstve, dvojnásobný titer, ktorý je tzv. pracovný názov. Napríklad, ak je skutočný titer I:2500 (alebo 1:2000), potom pracovný titer zodpovedá zriedeniu 1:1250 (alebo 1:W00).

P o d u j e n i e komponentčerstvé sérum, lymfa, tkanivové tekutiny odlišné typy zvieratá (a ľudia); objavil Buchner (1889). U hmyzu chýba doplnok. Komplement je látka bielkovinovej povahy, komplexnej štruktúry, rýchlo inaktivovaná zahriatím, dlhším skladovaním, vystavením ultrafialovému žiareniu, silnému pretrepávaniu, filtrácii cez keramické filtre, pridaním kaolínu, kyselín, zásad, alkoholu, acetónu, chloroformu, destilovaná voda, suspenzia baktérií a pod. Doplnok možno konzervovať pridaním 5 g síranu sodného, ​​4 g na 100 ml séra z morčiat kyselina boritá. Aktivita doplnku sa udržiava až šesť mesiacov. Najlepšia cesta konzervovanie - sušenie vo vákuu pri nízkej teplote (lyofilizácia). V zapečatených ampulkách sa v tomto stave uchováva dva roky. Pred každou produkciou RSK sa titráciou skontroluje aktivita komplementu, to znamená, že sa stanoví jeho titer - optimálne množstvo potrebné pre túto reakciu. Komplement sa titruje dvakrát: v hemolytických a bakteriolytických systémoch.

Pre titrácia komplementu v hemolytickom systéme komponenty sa pripravujú: komplement v riedení 1:20 (1 ml komplementu + 19 ml fyziologického roztoku); hemolyzín, zriedený podľa pracovného titra; suspenzia premytých ovčích erytrocytov (1:40), fyziologický roztok. Skúmavky sa umiestnia na statív a pomocou odmernej pipety s intervalom 0,03 ml sa do nich naleje rôzne množstvo komplementu (0,13; 0,16; 0,19; 0,22 ..: do 0,43 ml). Potom pridajte zvyšné komponenty (obr. 57). Všetky skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa do vodného kúpeľa s teplotou 37...38 °C na 10...15 minút a výsledok sa zaznamená.

Započítanie výsledku: najmenšie množstvo komplementu, ktoré poskytlo úplnú hemolýzu (v tomto príklade 0,25 ml), sa berie ako titer komplementu.

Výsledok titrácie sa berie do úvahy v skúmavkách s najviac skvelý obsah komplementu, kde sa predpokladá predovšetkým hemolýza. Najmenšie množstvo komplementu, ktoré za týchto podmienok zabezpečuje úplnú hemolýzu erytrocytov, sa nazýva titra komplementu v hemolytickom systéme.

Pre titrácia komplementu v bakteriolytickom systéme je potrebné mať všetky zložky reakcie: komplement (1:20), erytrocyty (1:40), hemolyzín v pracovnom titri, dve pozitívne a dve normálne séra, špecifický antigén. Séra sa zriedia fyziologickým roztokom 1:10, inaktivujú sa 30 minút pri 56...58 X. Každé sérum sa naleje do dvoch radov 0,5 ml skúmaviek. Doplnok sa pridáva v rastúcich množstvách do skúmaviek každého radu, ako pri titrácii v hemolytickom systéme; začnite s množstvom, ktoré sa vezme ako titer v hemolytickom systéme, potom sa v každej ďalšej skúmavke dávka zvýši o 0,03 ml, pričom sa objem vyrovná na 0,5 ml fyziologickým roztokom.

Potom sa do jedného radu skúmaviek s pozitívnym a normálnym sérom pridá 0,5 ml antigénu a do druhého radu každého séra sa pridá 0,5 ml fyziologického roztoku. Všetky skúmavky sa pretrepú a umiestnia do vodného kúpeľa na 30–40 minút. Potom sa do všetkých skúmaviek pridá 0,5 ml hemolyzínu a 0,5 ml erytrocytov, pretrepe sa a umiestni sa na 10-15 minút do vodného kúpeľa. Najmenšie množstvo komplementu, ktoré zabezpečilo úplnú lýzu erytrocytov v oboch radoch skúmaviek (s antigénom aj bez antigénu) dvoch normálnych sér, v jednom rade (bez antigénu) každého pozitívneho séra a s úplným oneskorením (absenciou) hemolýzy v nazývajú sa rady pozitívnych sér s antigénom (v tých istých dávkach komplementu). komplementový titer, ktorý sa používa pri formulovaní hlavných skúseností RSC v diagnostických štúdiách.

Hlavná skúsenosť RSC (v skutočnosti diagnostická štúdia). Dva rady skúmaviek sa umiestnia do stojanov podľa počtu skúmaných vzoriek séra. 0,5 ml každého inaktivovaného séra sa naleje do dvoch skúmaviek: do jednej sa pridá antigén - 0,5 ml, do druhej sa pridá 0,5 ml fyziologického roztoku (bez antigénu) a po pridaní komplementu tvoria bakteriolytický systém, a potom pridajte hemolytický systém.

Požadované zložky: 1) testovacie sérum, inaktivované, zriedené fyziologickým roztokom v pomere 1:10; 2) špecifický antigén zriedený podľa titra uvedeného biofabrikou na obale; 3) doplnenie v stanovenom titri; 4) hemolyzín v pracovnom titri; 5) suspenzia premytých ovčích erytrocytov 1:40; 6) soľný roztok NaCl. Testovacie séra sa nalejú do dvoch radov skúmaviek. Pre akýkoľvek počet testovaných sér sa ako kontroly používajú známe pozitívne séra (ktoré poskytujú pozitívny výsledok) a normálne séra (zo zdravého zvieraťa s negatívnym výsledkom).

Skúmavky so zložkami bakteriolytického systému sa pretrepú, umiestnia sa do vodného kúpeľa na 20...40 min pri 37...38°C. Skúmavky bakteriolytického systému druhého radu bez antigénu sa pretrepú a umiestnia sa do vodného kúpeľa za rovnakých podmienok.

Potom sa zložky hemolytického systému pridajú do všetkých skúmaviek prvého a druhého radu a umiestnia sa druhýkrát do vodného kúpeľa na 10 až 15 minút. Vo všetkých skúmavkách druhého radu bez antigénu dochádza k úplnej hemolýze.

Kým sa nedosiahne konečný výsledok, skúmavky sa nechajú pri izbovej teplote 18 ... .

Indikácie reakcie v skúmavkách s testovacími sérami sa považujú za spoľahlivé, ak nedôjde k hemolýze v skúmavkách s pozitívnym sérom a antigénom, k úplnej hemolýze v skúmavkách s pozitívnym sérom bez antigénu a vo všetkých skúmavkách so známym normálnym sérom (obr. 61).

Táto reakcia by mala byť sprevádzaná kontrolami antigénu, komplementu, hemolyzínu, erytrocytov. Za týmto účelom sa antigén s ovčími erytrocytmi naleje do samostatných skúmaviek; komplement s erytrocytmi bez hemolyzínu; hemolyzín s erytrocytmi bez komplementu; erytrocyty a fyziologický roztok. Objem v každej skúmavke sa upraví fyziologickým roztokom na 2,5 ml. Skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa na 20 minút do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C. Všetky kontrolné skúmavky by mali byť bez hemolýzy.

výsledok RSC zvyčajne vyjadrené krížikmi. Indikátory pozitívneho výsledku reakcie: + + + + (///) - úplná sedimentácia erytrocytov (bez hemolýzy), kvapalina nad sedimentom je bezfarebná, + + + (///) - kvapalina nad sedimentom je sotva badateľne sfarbená do žlta. Pochybný výsledok reakcie: prítomnosť erytrocytov usadených na dne a čiastočné zafarbenie tekutiny nad usadeninou v dôsledku lýzy niektorej časti erytrocytov sú označené + + - (++), teda dva a dva a a polovičné krížiky. Výrazná hemolýza (bez sedimentu) alebo s malým sedimentom (+) je negatívny výsledok.

Reakcia dlhodobej fixácie komplementu (RDSC). Efektívnejšie v citlivosti, na rozdiel od bežného klasického RSC. Podstatou reakcie je, že bakteriolytický systém je udržiavaný na troch rôznych teplotné podmienky: po zmiešaní zložiek pri izbovej teplote počas 15 minút, potom pri nízkej teplote (4 ° C) v chladničke počas 18 ... 20 hodín a vo vodnom kúpeli počas 15 minút. Potom sa pridá hemolytický systém, pretrepe sa, opäť sa umiestni do vodného kúpeľa a reakcia sa zaznamená ako v RSC. Potvrdila sa účinnosť RDSC v diagnostike množstva infekčných ochorení (tuberkulóza, vibrióza, brucelóza atď.).

Reakcia potlačenia väzby komplementu (RPSK) alebo inhibičná reakcia, nepriama RSK. Na tejto reakcii sa podieľa aj ďalšia zložka - štandardné imunitné sérum s protilátkami proti antigénu, ktorý sa zvyčajne používa na diagnostiku, a preto pozitívne reaguje v klasickom CSC.

Testované sérum sa zmieša s antigénom a ponechá sa nejaký čas bez komplementu. Potom sa pridá doplnok a štandardné sérum, skúmavky sa pretrepú a umiestnia sa do vodného kúpeľa na 20...30 minút, potom sa pridá hemolytický systém a vloží sa späť do vodného kúpeľa. Ak nedôjde k hemolýze, výsledok je negatívny, pretože testované sérum nereagovalo s antigénom a ten reagoval s štandardné sérum väzbou komplementu. Ak je testované sérum z chorého zvieraťa, obsahuje špecifické protilátky vo vzťahu k antigénu, t.j. dochádza k reakcii medzi antigénom a protilátkami bez väzby komplementu. Antigén interagujúci s protilátkami testovacieho séra nereaguje (je potlačený) so štandardným (samozrejme známym špecifickým) sérom, komplement zostáva voľný a reaguje v hemolytickom systéme - dochádza k hemolýze, výsledok reakcie je pozitívny vo vzťahu k testovanému séru.

Metóda fluorescenčné protilátky (MFA). Možnosti tejto metódy sú dané špecifickosťou prvej fázy sérologických reakcií s vysokou citlivosťou luminiscenčnej analýzy. Na implementáciu MFA je potrebné mať vysoko špecifické imunoluminiscenčné séra. Je známe, že rôzne sérologické testy používané v mikrobiologickej praxi zahŕňajú najmä tri zložky: bakteriálny antigén, protilátku a komplement. Všetky tri zložky sú v skutočnosti antigény a imunitné séra, a teda proti každému z nich možno získať luminiscenčné protilátky. Podľa toho, aký typ luminiscenčného séra sa použije (proti bakteriálnemu antigénu, antibakteriálnym protilátkam, komplementu), sa rozlišujú tri hlavné varianty metódy fluorescenčných protilátok: priamy (1) a nepriamy (2) variant a modifikácia nepriameho variantu pomocou komplementu. Imunologická reakcia medzi antigénom a protilátkou sa v týchto modifikáciách uskutočňuje priamo na podložnom sklíčku. Na fixáciu mikroorganizmov sa používajú organické rozpúšťadlá: acetón, etanol, metanol, dioxán, ako aj bežné fixačné prostriedky používané v mikrobiologickej praxi: formalín, Nikiforovova zmes, Carnoyova kvapalina atď.

Priama možnosť. Na hotový výrobok sa aplikuje špecifické luminiscenčné sérum určitý čas Potom sa prebytočné sérum vypustí, liek sa premyje a prezrie pod fluorescenčným mikroskopom. Táto metóda sa používa na detekciu baktérií v patologickom materiáli, predmetoch vonkajšie prostredie, ako aj na identifikáciu patogénov v kultúrach.

Nepriama (dvojstupňová) možnosť. V prvej fáze dochádza k špecifickému spojeniu antigénu s príslušnou protilátkou neznačeného séra. V druhom štádiu sa špecifická neznačená protilátka viaže na protidruhovú luminiscenčnú protilátku obsiahnutú v sére zvieraťa imunizovaného globulínmi (alebo sérom z plnej krvi) živočíšneho druhu, z ktorého bolo imunitné sérum použité.

Nepriamy antikomplementárny (trojkrokový) variant. Prvá fáza: tvorba komplexu protilátok neoznačených antigénom. Druhý krok: vrstvenie normálneho séra obsahujúceho komplement. Tretí stupeň: komplex antigén-protilátka-komplement sa ošetrí luminiscenčným antikomplementárnym sérom pripraveným počas imunizácie králikov sérom živočíšneho druhu, ktoré slúžilo ako zdroj komplementu.

Nepriame varianty MFA sa môžu použiť na detekciu antigénu aj detekciu protilátok. Pre nastavenie dvojstupňového variantu je navyše potrebné disponovať limitovanou sadou antidruhových luminiscenčných sér (proti globulínom býka, ovce, koňa, prasaťa a pod.) a pre antikomplementárny variant napr. proti morčacím globulínom stačí mať len jedno luminiscenčné sérum.

Technika a imunoluminiscencia a mikroskopia. V praxi veterinárnych bakteriologických laboratórií sa používajú luminiscenčné séra biofabrikovanej výroby. V závislosti od typu fluorochrómu poskytujú luminiscenčné séra buď zelenú žiaru predmetu (farbivo na báze fluorescencie) alebo červené (farbivo na báze rodamínu).

Na vykonanie imunoluminiscenčnej mikroskopie by sa mal testovaný materiál aplikovať na odtučnené, tenké sklenené sklíčko bez škrabancov. Pri štúdiu orgánov a tkanív zvierat sa prípravky-odtlačky pripravujú v tenkej vrstve. Prípravky sa vysušia na vzduchu a umiestnia sa do fixačnej kvapaliny (etanol - 15 minút, metanol - 5 minút, acetón - 5 minút). Ak je to potrebné, po fixácii môžu byť prípravky nejaký čas skladované v chladničke. Poradie a ďalšie postupy závisia od typu použitej MFA (jednostupňový, dvojstupňový, trojstupňový). Ošetrenie prípravkov luminiscenčnými sérami, ako aj neznačenými sérami prvého stupňa a komplementom, sa uskutočňuje pri 37 X vo vlhkej komore (Petriho misky s navlhčeným filtračným papierom).

Jednostupňová možnosť. Luminiscenčné sérum sa nanesie na podložné sklíčko s fixným testovacím materiálom (v riedení uvedenom na ampulke). Liečivo sa umiestni do vlhkej komory na 15...20 minút pri 37 °C. Potom sa premyje pufrovaným fyziologickým roztokom (pH 7,4) v nádobe, pričom roztok sa po 5...10 minútach niekoľkokrát vymieňa alebo pod tečúcou vodou z vodovodu po dobu 3...5 minút Voda by mala byť neutrálna a bez železa. Potom sa prípravok (na jednom pohári môže byť niekoľko škvŕn) vysuší na vzduchu alebo na filtračnom papieri a potom sa pridá kvapka pufrovaného glycerolu Nanesie sa pH 8,0 a prekryje sa krycím sklíčkom. Na krycie sklíčko sa nanesie ponorná nefluorescenčná kvapalina a podrobí sa mikroskopii.

Dvojstupňová možnosť. Na podložné sklíčko s testovaným materiálom sa nanesie kvapka imunitného neznačeného séra prvého štádia. Liečivo sa umiestni do termostatu vo vlhkej komore na 15...20 minút. Potom sa premyje, ako je opísané vyššie, vysuší sa a nanesie sa kvapka luminiscenčného protidruhového séra. Liečivo sa opäť umiestni do termostatu vo vlhkej komore na 15-20 minút. Premývací postup zopakujte a vysušte filtračným papierom. Nanesie sa pufrovaný glycerol, prekryje sa krycím sklíčkom, nanesie sa nefluorescenčná imerzná kvapalina a mikroskopuje sa.

Trojstupňový variant (antikomplementárny). Na podložné sklíčko s testovaným materiálom sa nanesie kvapka imunitného neznačeného séra prvého štádia. Liečivo sa umiestni do termostatu, ako je opísané vyššie, vysuší sa a na náter sa aplikuje kvapka komplementu. Liečivo sa opäť umiestni do vlhkej komory a do termostatu na 15...20 minút, potom sa premyje a aplikuje sa luminiscenčné antikomplementárne sérum. Nasledujúce postupy sú podobné ako pri jednostupňovej možnosti.

Príprava a spracovanie kontrolných prípravkov. 1. Pri priamej voľbe, aby sa určila špecifickosť reakcie medzi antigénom s luminiscenčným sérom, mali by sa prípravky sterov z heterológnych mikrobiálnych druhov ošetriť rovnakým sérom. Tieto druhy by mali byť antigénne podobné, ale odlišovať sa morfológiou od študovaných mikroorganizmov; vzdialené v antigénnom vzťahu k študovaným mikroorganizmom, ale podobné v morfológii a distribúcii s nimi. Prípravky na odtlačky sú ošetrené luminiscenčným normálnym sérom.

2. Pre nepriamy variant je potrebné mať tri kontrolné prípravky ošetrené normálnym sérom, luminiscenčným protidruhovým sérom bez imunitne neznačeného séra a luminiscenčným protidruhovým sérom so známym imunitným sérom I. stupňa.

3. Pre nepriamu možnosť s doplnkom sú potrebné kontrolné prípravky, pri spracovaní ktorých sa imunitné sérum nahradí normálnym sérom rovnakého typu a v rovnakých riedeniach, ako aj prípravky ošetrené všetkými zložkami okrem imunitného séra.

Vyhodnotenie výsledkov. Zohľadňuje sa jas, farba, lokalizácia a štruktúra žiary. Baktérie zafarbené luminiscenčným sérom značeným fluoresceín izotiokyanátom majú po obvode jasnú zelenú žiaru vo forme lemu alebo halo, stredná časť žiari slabo. Takáto žiara sa nazýva špecifická, na rozdiel od nešpecifickej, keď celé telo bunky žiari rovnomerne. Čím konvexnejšia bunka baktérie v prípravku leží, tým ostrejší je okraj. Túto žiaru možno vysvetliť skutočnosťou, že na sietnicu pozorovateľa sa z jednotkovej oblasti „periférie“ bunky premieta niekoľkonásobne viac protilátok ako z centrálnej časti bunky mikróbu. Malo by sa pamätať na to, že plastové bunky (leptospiry, vibriá) nemajú obrys alebo je sotva viditeľný. V bunkách ponorených do tkanivového moku a v mladých baciloch antrax obrys býva vyjadrený neostro.

Intenzita luminiscencie sa hodnotí podľa štvorkrížového systému: + + + + - veľmi jasná fluorescencia pozdĺž periférie mikrobiálnej bunky, jasne kontrastujúca s tmavým telom bunky; + + + - jasná fluorescencia bunkovej periférie; + + - slabá žiara periférie bunky; + - žiadna kontrastná žiara periférie mikrobiálneho bunkového tela. Neprítomnosť špecifickej žiary je označená „-“ (sú viditeľné tiene mikroorganizmov). Pri diagnostike rôznych patogénov pozitívny výsledok najčastejšie sa špecifická luminiscencia bakteriálnych buniek považuje za nie nižšiu ako štyri alebo tri kríženia.