Имунни реакции. Приложение на имунните реакции в диагностиката инфекциозни заболявания.
ПЛАН:
Видове имунни реакции.
Условия за провеждане на серологични реакции.
Серумни изисквания.
Концепцията за положителни и отрицателни резултати.
ОСНОВНО СЪДЪРЖАНИЕ:
Видове имунни реакции.
Имунологична реакция – Това е взаимодействието на антиген с антитяло, което се определя от специфичното взаимодействие на активните центрове на антитялото (паратоп) с епитопи на антигени.
Обща класификация на имунологичните реакции:
серологични реакции – реакции между антигени (Ag) и антитела (Ig)
инвитро ;
клетъчни реакции с участието на имунокомпетентни клетки;
тестове за алергия – откриване на свръхчувствителност.
Серологични реакции: 1) определение, 2) фази, 3) цели, 4) обща класификация.
1) Определение
Серологични методиизследване (от латински Serum - серум и logos - преподаване), използвайки реакцията антиген-антитяло.
2) Фази
2 фази на взаимодействие:
аз Специфични (видим) – възниква бързо, антителата се свързват със съответните им антигени. По време на тази фаза взаимодействат детерминантни групи от антигени (AG) и активни центрове на антитела (AT).
Силите, участващи във формирането на комплекса AG + AT, са:
висулка;
ван дер Ваалс
Водородни връзки.
В тази фаза няма видими промени. Електронната микроскопия показва комплекса AG+AT под формата на решетка.
II. Неспецифични – протича бавно, полученият комплекс антиген-антитяло реагира с допълнителен неспецифичен фактор от околната среда, в който протича реакцията, и това е видимо за окото – слепване, разтваряне, утаяване на люспи и др. При наличие на електролит зарядът намалява , разтворимостта намалява, образуват се видими конгломерати, утаяват се (аглутинират).
3) Поставяне на цели :
а) за идентифициране на антигена (антитяло известен диагностичен серум):
серологична идентификация (видова идентификация);
серотипиране (определяне на серовар) – определяне на щама;
в патологичен материал (бърза диагностика);
в чиста култура:
б) за откриване на антитела (Ig) (известен е антиген-diagnosticum):
присъствие (качествени реакции);
количества (повишаване на титъра - метод на “сдвоен серум”).
4) Обща класификация серологични реакции :
а) прост (2-компонентен: Ag+Ig):
РА реакции на аглутинация (с корпускуларен антиген);
PR реакции на утаяване (с разтворим антиген);
б) комплексен (3-компонентен: Ag+Ig+C);
в) с помощта на етикет.
Варианти на реакциите на аглутинация и утаяване
Реакция на аглутинация :
Реакция на аглутинация (RA) - имунна реакциявзаимодействие на суспензия от антигени (еритроцити, бактерии) с антигени в физиологичен разтвор.
По време на аглутинацията, AT частиците се слепват, за да образуват флокулентна утайка.
реакция пасивна хемаглутинация(RPGA) е вид реакция на аглутинация, при която се използва антитяло или антигенен еритроцитен диагностикум (еритроцити с адсорбирана на повърхността им АТ или АГ).
Червените кръвни клетки действат като пасивни носители в тази реакция.
Оценката на резултатите от RPGA се извършва, както следва:
- при положителна реакция пасивно залепнали червени кръвни клетки покриват дъното на U- или V-образния отвор в равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“);
- при отрицателна реакция (при липса на аглутинация), червените кръвни клетки се натрупват в централната вдлъбнатина на дупката, образувайки компактен „бутон“ с рязко дефинирани ръбове.
При диагностицирането се използва тестът за инхибиране на хемаглутинацията (HIT). вирусни инфекции. Някои вируси съдържат протеин, наречен хемаглутинин на повърхността си, който слепва червените кръвни клетки. Добавянето на специфични антивирусни антитела блокира вирусния хемаглутинин – няма хемаглутинация.
Реакцията на непряка хемаглутинация (IRHA) или реакцията на Coombs се използва за определяне на непълни антитела. Добавянето на антиглобулинов серум (AT срещу човешки Ig) подобрява резултатите от реакцията. RNGA се използва за определяне на Rh фактора.
За извършване на реакция на аглутинация (RA) са необходими три компонента:
1) антиген (аглутиноген) AG;
2) антитяло(аглутинин) AT;
3)
електролит
(изотоничен разтвор на натриев хлорид).
Ag + AT + електролит = аглутинат
Аглутинация (от латински agglutinatio - слепване) - слепване на телца (бактерии, червени кръвни клетки и др.) с антитела в присъствието на електролити - натриев хлорид.
RA се проявява под формата на люспи или утайка, състояща се от корпускули (например бактерии, червени кръвни клетки), „слепени заедно“ от антитела.
RA се използва за:
Реакция на директна микробна аглутинация (RA).
При тази реакция антителата (аглутинини) директно аглутинират корпускулните антигени (аглутиногени).
Обикновено те са представени от суспензия от инактивирани микроорганизми (реакция на микробна аглутинация).
За да определите вида на микроорганизмите, използвайтестандартна диагностична аглутинация серум (известен AT ).
Най-често срещаните са ламеларен (приблизителен) и разширен RA.
Плочата RA се поставя върху стъклото. Използва се като ускорен метод за откриване на антитела или идентифициране на микроорганизми.
Компоненти:
1. стандартни диагностични аглутиниращи серуми (АТ);
2. изследвана чиста култура от пациента;
3. физиологичен разтвор.
В изследваната чиста култура антигените (АГ) са под формата на частици (микробни клетки, еритроцити и други корпускулярни антигени), които се слепват от антитела и се утаяват.
Пример:
Постановка показателен реакции на аглутинация (RA ) на стъкло с цел идентифициране на колиформни бактерии.
Нанесете капки върху предметно стъкло:
1
дизентерия
;
2
-та капка: - аглутиниращ серум срещу патогениКоремен тиф
;
(1-2 диагностични серума)
3
-та капка: - физиологичен разтвор (контрола).
Добавете тестваната чиста бактериална култура към всяка капка. Разбъркайте.
Резултат
:
положителен
- наличие на аглутинирани люспи,
отрицателен
- липса на аглутинирани люспи
Заключение:Изследваните бактерии са причинители на коремен тиф (определени са антигени).
За определяне на AT в серума на пациента (серологична диагноза) стандартен микробендиагностикум , съдържащ суспензияизвестен микроби или техни антигениАГ .
Определяне на ABO кръвни групи (реакция на хемаглутинация (HRA)) – аглутинират червени кръвни клетки.
Компоненти на реакцията:
1. AG (червени кръвни клетки) кръвен тест
2. АТ (еритротести - золиклони)
Набор от золиклони:
Coliclone анти-А реагент (розов)
Coliclone анти-B реагент (син)
Реагент Tsoliklon anti-AV (безцветен)
3. електролит (физиологичен разтвор)
Техника за определяне:
1
.
Една капка (0,1 ml) анти-А, анти-В и анти-АВ золикон се нанася в ямките на таблетката (за контрола).
2.
До всяка капка от реагента се поставя малка (0,05-0,01 ml) капка от изследваната кръв.
След това капка золиклон се смесва с капка кръв с помощта на индивидуална чиста стъклена пръчка.
3.
Реакцията на аглутинация се развива през първите 3-5 секунди, когато плаката се разклати леко.
Резултатите от реакцията се вземат предвид 2,5 - 3 минути след смесване на капките. Отляво надясно в ямките са анти-А, анти-В, анти-АВ.
Положителен резултат е появата на зърнеста утайка (аглутинат).
положителен RA (+)
Отрицателен - без утайка.
отрицателен RA(-)
4.
Анализ на резултатите.
О(аз) α β – няма аглутинация
А(II) β – аглутинация с анти-А
б(III) α – аглутинация с анти-В
AB(IV)O – аглутинация с анти-А, с анти-В
Схематично представяне на аглутинацията.
Ag антигени върху еритроцити (откриваеми) + антитялоAT(золиклон) диагностичен серум
Отчитане на аглутинацията в таблетки
Реакция на утаяване:
Реакцията на утаяване е имунна реакция на взаимодействието на антиген в разтворимо състояние с антиген във физиологичен разтвор.
По време на утаяването се образува макромолекулен имунен комплекс, който се проявява чрез прехода на прозрачен колоиден разтвор в непрозрачна суспензия или утайка.
Количеството на двата реагента трябва да бъде в строго определени пропорции, тъй като излишъкът на един от тях намалява резултата.
Съществуват различни начинипоставяне на реакцията на утаяване.
1. Реакцията на пръстеновидно утаяване се провежда в утаителни тръби с малък диаметър. Имунният серум се добавя към епруветката и разтворимият антиген се наслоява внимателно. AG и AT се смесват поради термичното движение на молекулите и те си взаимодействат. При положителен резултатна границата на двата разтвора се образува пръстен от непрозрачна утайка.
2. Реакцията на двойна имунодифузия на Ouchterlony се провежда в агар гел, в ямките на който се добавя или AG разтвор, или AT разтвор съгласно схемата. AG и AT дифундират в гела един към друг и, ако реакцията е положителна, образуват имунни комплекси, видими като линии на утаяване.
Реакция на утаяване –това е формиранеи утаяване на разтворимия молекулярен комплекс антиген-антитяло като облак, наречен преципитат. Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества.
RA компоненти:
преципитиращ серум (известен АТ-преципитин);
тестов серум (неизвестен преципитогенен антиген);
физически Решение.
Реакцията на утаяване се извършва или в специални тесни епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване), или в петриеви панички в гелове, хранителни среди и др.
Реакция на пръстеновидно утаяване
Изявление и записване на резултатите от реакциятапръстеновидни валежиза откриване на патогени антракс(реакция на Асколи).
Постановка .
1. Изследваният материал (кожа, вълна, филц, четина, плат, месо, пръст, животински изпражнения и др.) се вари в солен разтвор за 5-45 минути. за получаване на изотоничен екстракт (екстракт). Филтриран.
2. Утаеният антиантраксен серум се излива в епруветка.
3. Внимателно наслоете тестовия материал (екстракт) върху него.
Счетоводство .
В рамките на следващите 10 минути. В положителни случаи се появява пръстен от мътност на границата между серума и екстракта (пръстеново утаяване). Реакцията на Асколи е много чувствителна и специфична
С негова помощ е възможно бързо да се идентифицират заразени с антракс материали.
Реакция на утаяване в агар
Изявление и записване на резултатитереакции на утаяване в агарза определяне на токсигенността на коринебактериите (причинители на дифтерия)
Постановка
Поставя се върху фосфат пептон агар в петриево блюдо.
1. Поставете лента от стерилна филтърна хартия, навлажнена по средата на чашата.антитоксичен серум.
2. След изсушаване, на разстояние 1 см от ръба на лентата, се посяват плаки с диаметър 10 мм.избрани култури.
В една чаша можете да засеете от 3 до 10 култури, една от коитоконтрол, трябва да се знаетоксигенен.
Културите се поставят в термостат.
Счетоводство
Анализът се извършва след 24-48-72 часа.
Положителен резултат - (културатоксигенен) - на известно разстояние от лентата хартия се появяватпреципитатни линии, « пипала стрели“, които са ясно видими в пропусната светлина.
Фигурата показва реакцията на утаяване в агар за определяне на токсигенността на дифтерийните бацили. Средните култури не са образували „пипала на стрели“; това не са токсикогенни патогени.
Щамовете на причинителя на дифтерия могат да бъдат токсигенни (произвеждащи екзотоксин) и нетоксигенни. Образуването на екзотоксин зависи от наличието в бактериите на профаг, носещ токсичен ген, кодиращ образуването на екзотоксин.
В случай на заболяване всички дифтерийни патогени се изследват за токсигенност - производство на дифтериен екзотоксин чрез реакцията на утаяване в агар
Комплексни серологични реакции ( 3-компонентен: Ag+Ig+C):
Реакция на свързване на комплемента (CFR).
Реакцията се провежда на два етапа.
На първия етап AT взаимодейства с антиген и комплемент, на втория етап се добавя индикатор - хемолитична система (смес от еритроцити и антиеритроцитен серум).
Ако резултатът е положителен, на първия етап антителата образуват имунен комплекс с антигените, който свързва комплемента на реакционната смес.
В този случай червените кръвни клетки на хемолитичната система, добавени на втория етап, не се унищожават.
В противен случай несвързаният комплемент причинява лизис на индикаторните червени кръвни клетки.
За осъществяването му са необходими пет съставки: АГ, АТ и комплемент (първа система), овчи еритроцити и хемолитичен серум (втора система) (фиг. 1).
Реакцията протича в две фази (фиг. 3).
Първа фаза - взаимодействие на антиген и антитела със задължителното участие на комплемента.
Второ - идентифициране на резултатите от реакцията с помощта на индикаторна хемолитична система (овчи червени кръвни клетки и хемолитичен серум). Разрушаването на червените кръвни клетки от хемолитичен серум става само ако към хемолитичната система се добави комплемент. Ако комплементът преди това е бил адсорбиран върху комплекса антиген-антитяло, тогава не настъпва хемолиза на еритроцитите (фиг.).
Резултат от опита
(фиг. 2), отбелязвайки наличието или липсата на хемолиза във всички тръби. Реакцията се счита за положителна, когато хемолизата е напълно забавена, когато течността в епруветката е безцветна и червените кръвни клетки се утаяват на дъното, отрицателна - когато червените кръвни клетки са напълно лизирани, когато течността е интензивно оцветена ("лакова" кръв ).
Степента на забавяне на хемолизата се оценява в зависимост от интензитета на цвета на течността и размера на утайката на червените кръвни клетки на дъното (++++, +++, ++, +).
Ориз. 4. Становище и резултат от RSC.
Заключение:В тестовия серум са открити антитела.
RSK ви позволява да откриете антитела към всеки щам от същия серотип на вируса.
Диагностична стойност има:
четирикратно увеличение на титъра на антителата в сдвоени серуми (по време на грипна епидемия);
двукратно увеличение на кръвния серум при пациенти с характерна клинична картина.
Реакции с помощта на етикет :
Тези методи са много чувствителни. Багрила, радиоактивни изотопи, ензими и др. се използват като етикети за антигени или антитела.
RIF – имунофлуоресцентна реакция
Имунофлуоресцентната реакция се основава на светлинна индикация на комплекса антиген-антитяло
Свързан имуносорбентен анализ.
Модерен лабораторно изследване, по време на който се извършва търсене на специфични антитела в кръвта или антигени към определени заболявания, за да се установи не само етиологията, но и стадият на заболяването.
Резултатите от ELISA могат да бъдат дадени качествено и количествено.
В момента ELISA се използва в следните ситуации:
1) търсене на специфични антитела към всяко инфекциозно заболяване;
2) търсене на антигени на всякакви заболявания (инфекциозни, венерологични);
3) изследване на хормоналния статус на пациента;
4) изследване за туморни маркери;
5) изследване за наличие на автоимунни заболявания.
На фигурата твърдофазният ELISA показва известни антигени (вляво), адсорбирани върху ямка на плоча, (вдясно) в ямки на плоча, известни антигени
Предимства на метода ELISA:
1) Висока специфичност и чувствителност на метода ELISA (повече от 90%).
2) Възможността за определяне на заболяването и проследяване на динамиката на процеса, т.е. сравняване на броя на антителата в различни периоди от време.
3) Наличие на ELISA диагностика във всяка медицинска институция.
Относителен недостатък: Откриване на имунен отговор (антитела), но не и самия патоген, конюгиран с маркерен ензим.
ELISA тест (общ механизъм):
Основата на ензимния имуноанализ е имунната реакция на антиген и антитяло с образуването на имунен комплекс: антиген-антитяло, в резултат на което настъпва промяна ензимна активностспецифични белези по повърхността на антителата.
Компоненти на реакцията:
1. AG(AT) известен - върху кладенеца на табличката.
2. AT (AG) се изучава.
3. AT с ензим, специфичен за комплекса AT(AG)-AG(AT).
4. хромогенен субстрат, който взаимодейства с ензима
5. стоп разтвор
Основни етапи на ELISA
1. На повърхността на ямките на плаката има пречистен антиген на специфичен патоген. Те добавят биологичен материалпациент, възниква специфична реакция между този антиген и желаното антитяло (имуноглобулин). Образува се комплекс.
2. Добавя се конюгант – AT с ензима. Конюгантът е специфичен за AT-AG комплекса от първия етап. Ензимът се активира.
3. Субстратът се добавя и активният ензим реагира с него, променяйки безцветния цвят на разтвора.
4. Добавя се стоп разтвор, за да се спре взаимодействието ензим-субстрат.
Счетоводство.
Положителен резултат е промяна в цвета, жълто на снимката.
Имунохроматографски анализ
Методът за имунохроматографски анализ (ICA, бързи тестове) е висококачествен метод за предварителен скрининг, който ви позволява бързо, в рамките на няколко минути, да извършите анализ при всякакви условия, вкл. "поле".
Предимствата на ICA включват:
Бързина и лекота на използване;
Малки обеми на пробите, липса на подготовка на пробите;
Евтина за производителя и потребителя;
Възможност за производство на тестове в големи обеми;
Лесно разчитане и тълкуване на резултата;
Висока чувствителност и възпроизводимост;
Възможност за количествено определяне;
Възможност за използване на преносими четци, съвместими с компютър;
Възможност за мулти-анализ.
Компоненти (приложени към тест лентата):
1. Конюгатът с колоиден златен етикет е специфичен за открития антиген.
2. AT тестова линия – специфична за AT-AG комплекса
3. Абс на контролната линия са специфични за конюгата.
ICA настройка:
1. Нанесете пробата върху определената начална зона на лентата.
2. Получаване на резултата под формата на появата на цветни ивици на мястото на тестовите и контролните линии.
Счетоводство
Положителен – когато тестовата линия е оцветена.
Отрицателен - ако няма оцветяване на тестовата линия.
Невалидно – ако контролната линия не е оцветена.
Общ механизъм IHA:
1. Пробата се въвежда в началното поле (подложка за проби) и се свързва с конюгата (специфично тяло с цветен етикет), който се намира на подложката за конюгат. В резултат на това се образува оцветен комплекс.
2. Полученият цветен имунен комплекс се движи под действието на капилярни сили по нитроцелулозната мембранаИ взаимодействас AT тестова линия.Резултатът е едноцветна розово-червена ивица.
3. AT (конюгат), който не е свързан с тестваната лентасе придвижва по-нататък и достига контролната линия, комуникира с АТ на контролната линия.В резултат на това се появява втора цветна ивица.Ако анализът е извършен правилно, контролната линия трябва винаги да се появява, независимо от наличието на тестовия антиген (антитела) в пробата от биологична течност.
2. Условия за провеждане на серологични реакции.
1. Наличие на хомоложни - съответстващи един на друг антиген и антитяло.
2. Чисти, сухи съдове.
3. Определено съотношение на лекарствата (най-често равно).
4. Задължително наличие на електролит (изотоничен разтвор на NaCl).
5. pH неутрално или близко до леко алкално.
6. Температура +37°C или стайна температура (задължително положителна).
7. Провежда се антигенен контрол и серум (антитела).
3 Серумни изисквания
Серумът трябва да бъде напълно прозрачен, без никакви примеси на клетки.
Обикновено го получават на 2-та седмица от заболяването, когато антителата вече са налични.
Кръвта се взема в количество от 3-5 ml на гладно или 6 часа след хранене.
За да се получи серум, кръвта се оставя за 1 час при стайна температура или се центрофугира. Серумът се изсмуква много внимателно, за да не се уловят образуваните елементи.
Имунните серуми се получават от кръвта на хора или животни (най-често зайци и коне), имунизирани по определена схема със съответния антиген (ваксина). Серумите обикновено се приготвят в производството.
4. Концепцията за положителни и отрицателни резултати.
RA.
При положителна реакция пасивно залепените червени кръвни клетки покриват дъното на дупката в равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“); при липса на аглутинация, червените кръвни клетки се натрупват в централната вдлъбнатина на отвора, образувайки компактен „копче“ с остри ръбове (вижте снимките по-горе).
RP.
Ако резултатът е положителен, на границата на двата разтвора се образува млечен пръстен (вижте снимките по-горе).
ELISA.
При положителна реакция настъпва промяна в цвета на разтвора.
RSK.
Забавена хемолиза - реакцията е положителна; ако комплементът е свободен се наблюдава хемолиза - реакцията е отрицателна(вижте снимките по-горе).
Резултати от реакцията на Васерман:
а - пълно забавяне на хемолизата (+ + ++);
b - изразено забавяне на хемолизата (+ ++);
c - частично забавяне на хемолизата (++);
d - леко забавяне на хемолизата (+);
d - пълна хемолиза (-).
Реакцията е положителна с частично, изразено и пълно забавяне на хемолизата, което се определя от степента на оцветяване на съдържанието на епруветките от светло розово до ярко червено; нехемолизираните еритроцити впоследствие образуват червена утайка.
Домашна работа:
1. Проучете материала
Направете 3 бележки към видеото
No 29 Реакция на аглутинация. Компоненти, механизъм, методи на монтаж. Приложение.
Реакция на аглутинация- проста реакция, при която антителата се свързват с корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: екстензивна, индикативна, непряка и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка (клетки, "залепени" с антитела, имащи два или повече антиген-свързващи центъра - фиг. 13.1). RA се използва за:
1) определяне на антителав кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), Коремен тифи паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;
2) определяне на патогена, изолиран от пациент;
3) определяне на кръвни групиизползване на моноклонални антитела срещу еритроцитни алоантигени.
За определяне на антитела при пациент извършете подробна реакция на аглутинация: Diagnosticum (суспензия от убити микроби) се добавя към разрежданията на кръвния серум на пациента и след няколко часа инкубация при 37 °C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което е настъпила аглутинация, т.е. утайка е била образувани.
Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това са особеностите на взаимодействието на диагностикуми (О- и Н-антигени) със специфични антитела. Реакцията на аглутинация с О-diagnosticum (бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилния О-антиген) протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалдехид, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е груба и протича по-бързо. Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете показателна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Провежда се индикативна реакция върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента, в разреждане 1:10 или 1:20. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, се извършва подробна реакция на аглутинация в епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращия серум, към който се добавят 2-3 капки суспензия на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на прозрачност на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се наблюдава аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
Различни сродни бактерии могат да бъдат аглутинирани от същия диагностичен аглутиниращ серум, който
ги прави трудни за идентифициране. Поради това те използват адсорбирани аглутиниращи серуми, от които
кръстосано реагиращи антитела чрез адсорбция към сродни бактерии. Антителата се запазват в такива серуми,
специфични само за дадена бактерия.
Аглутинацията е слепване на бактерии в резултат на взаимодействието на специфични АТ с тях. За провеждане на РА са необходими три компонента: 1) АГ (аглутиноген); 2) АТ (аглутинин); 3) електролитен разтвор (изотоничен разтвор на натриев хлорид). В реакцията на аглутинация участват само корпускулярни антигени (бактерии, червени кръвни клетки, натоварени с антиген латексови частици).
Реакция на аглутинация върху стъкло. Капка диагностичен серум се нанася върху обезмаслено предметно стъкло с пипета (серумно разреждане 1:10 - 1:20). С помощта на бактериологична примка се взема чиста култура на изследвания микроорганизъм от повърхността на наклонения агар, прехвърля се в капка серум и се смесва. Резултатът от реакцията се отчита с просто око след 3-5 минути. Ако реакцията е положителна, се забелязва появата на люспи (големи или малки) в капка серум, ясно видими на тъмен фон, когато предметното стъкло се разклати. При отрицателна реакция течността остава равномерно мътна.
Реакция на аглутинация в епруветки. В редица епруветки се добавя 1 ml физиологичен разтвор. Към първата епруветка се добавя равен обем от тествания кръвен серум. Приготвят се серийни двукратни разреждания на серум (серумно титруване), след което във всяка епруветка се добавят 2 капки суспензия от инактивирани бактерии (diagnosticum). Епруветките се поставят в термостат при 37 °C за 2 часа. Реакцията протича с образуването на малки люспи, невидими с невъоръжено око, поради което резултатите се записват при леко увеличение в специален уред - аглутиноскоп. Интензивността на аглутинацията се взема предвид по системата "четири плюс": пълна аглутинация - 4+, частична аглутинация - 3+ или 2+, съмнителен резултат - +. Последното разреждане, при което се наблюдава аглутинация 2+, се приема като титър на антитела в тестовия серум.
Провежда се реакция на аглутинация в епруветки (реакция на екстензивна аглутинация) за определяне на титъра на антителата срещу причинителите на коремен тиф и паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакция на Райт) и тиф (реакция на Weigl).
Аглутинацията (от латински agglutinatio - слепване) е слепване (свързване) на антиген-носещи корпускулярни частици (цели клетки, латексни частици и др.) с молекули на специфични антитела в присъствието на електролити, което завършва с образуването на люспи или утайка (аглутинират) видими с просто око. Естеството на утайката зависи от естеството на антигена: камшичестите бактерии произвеждат груба флокулентна утайка, камшичестите и некапсулните бактерии произвеждат финозърнеста утайка, а капсулните бактерии произвеждат нишковидна утайка. Прави се разлика между директна аглутинация, при която собствените антигени на бактериална или друга клетка, като еритроцити, участват директно във взаимодействието със специфични антитела; и косвени или пасивни, при които бактериални клетки или еритроцити, или частици от латекс са носители не на собствените си, а на чужди антигени (или антитела), сорбирани върху тях, за да идентифицират антитела (или антигени), специфични за тях. Реакцията на аглутинация включва главно антитела, принадлежащи към класовете IgG и IgM. Протича в две фази: първо, възниква специфично взаимодействие между активния център на антителата и антигенната детерминанта; този етап може да възникне при липса на електролити и не е придружен от видими промени в реагиращата система. За втория етап - образуването на аглутинат - е необходимо наличието на електролити, които намаляват електрически зарядкомплекси антиген + антитяло и ускоряват процеса на тяхното слепване. Тази фаза завършва с образуването на аглутинат.
Реакциите на аглутинация се извършват върху стъклени или гладки картонени плочи или в стерилни епруветки за аглутинация. Обикновено се използват реакции на аглутинация (директни и пасивни) върху стъкло ускорен методоткриване на специфични антитела в серума на пациента (например при бруцелоза) или за серологична идентификация на патогена. В последния случай обикновено се използват добре пречистени (адсорбирани) диагностични серуми, съдържащи само монорецепторни антитела или набор от тях към различни антигени. Безспорното предимство на реакцията на аглутинация върху стъкло е простотата на нейното изпълнение и факта, че отнема няколко минути или дори секунди, тъй като и двата компонента се използват в концентрирана форма. Той обаче има само качествена стойност и е по-малко чувствителен от епруветка. Обширната реакция на аглутинация в епруветките дава по-точни резултати, тъй като ви позволява да определите количественото съдържание на антитела в серума (установите неговия титър) и, ако е необходимо, да регистрирате факта на повишаване на титъра на антителата, което има диагностична стойност . За да се постави реакцията, разреден 0,85% разтвор се добавя към аглутинационните епруветки по определен начин. разтвор на NaClсерум и равен обем (обикновено 0,5 ml) суспензия от стандартен диагностикум (или тест култура), съдържаща 1 милиард бактерии в 1 ml. Резултатите от реакцията на аглутинация се записват първо след 2 часа инкубация на епруветките при 37 °C и накрая след 20-24 часа според два критерия: наличието и размера на утайката и степента на прозрачност на супернатантната течност. Оценяването се извършва по четирикратната система. Реакцията е задължително придружена от серум и антигенен контрол. В случаите, когато се извършва подробна реакция на аглутинация в епруветка за серологично идентифициране на патогена, тя има диагностична стойност, ако реакцията се оцени като положителна, когато диагностичният серум е разреден до поне половината от титъра.
Трябва да се има предвид, че при смесване на разтвори на хомоложни антигени и антитела не винаги се наблюдават видими прояви на реакцията на аглутинация. Утайка се образува само при определени оптимални съотношения на двата компонента на реакцията. Извън тези граници, при значителен излишък на антиген или антитела, не се наблюдава реакция. Това явление се нарича „прозонов феномен“. Наблюдава се както при реакцията на аглутинация, така и при реакцията на утаяване. Появата на прозона в имунните реакции се обяснява с факта, че участващите в тях антигени като правило са полидетерминантни, а молекулите IgG антителаимат два активни центъра. При излишък от антитела повърхността на всяка антигенна частица е покрита с молекули на антитела, така че не остават свободни детерминантни групи, така че вторият, несвързан активен център на антителата не може да взаимодейства с друга антигенна частица и да ги свърже един с друг. Образуването на видим аглутинат или преципитат също се потиска, когато има излишък от антиген, когато не остава нито един свободен активен център на антителата и следователно комплексите антиген + антитяло + антиген вече не могат да се увеличават.
Възможности за ускорени реакции на аглутинация. Реакция на пасивна хемаглутинация и нейните варианти
Класическата реакция на аглутинация включва използването на корпускулярни антигени. Въпреки това могат да бъдат включени и разтворими антигени. За да стане това възможно, такива антигени се адсорбират върху имунологично инертни частици. Частиците от латекс или бентонит могат да се използват като носител, но в момента най-често се използват животински или човешки еритроцити, подобрявайки техните адсорбиращи свойства чрез третиране с разтвори на танин, формалин или бензидин. Червените кръвни клетки, които са адсорбирали антиген върху себе си, се наричат сенсибилизирани от този антиген, а имунната реакция, в която участват, се нарича индиректна или пасивна реакция на хемаглутинация (IRHA или RPHA), тъй като червените кръвни клетки участват в нея пасивно.
RPGA се поставя в специални полистиренови плочи с отвори с полусферично дъно. Когато се използва за серологична диагностика, в тези ямки се приготвят двукратни разреждания на тестовия серум във физиологичен разтвор и след това към него се добавя суспензия от сенсибилизирани еритроцити като диагностичен агент. Резултатите се записват след 2 часа инкубиране при 37 °C, като се използва системата с четири кръста. При положителна реакция аглутинираните червени кръвни клетки се утаяват на дъното на дупката и я покриват равномерно под формата на обърнат чадър. Ако реакцията е отрицателна, червените кръвни клетки също се утаяват, течността става бистра и утайката изглежда като малък „диск“ в центъра на ямката. Серумният титър в RPHA се счита за последното му разреждане, което все още дава изразена хемаглутинация без значими знациналичието на "диск".
RPGA може да се използва и като ускорен метод за бактериологична диагностика за откриване директно в тестовия материал на неизвестни бактерии, вируси, токсини, например патогени на чума, стафилококови ентеротоксини и др. С тази версия на RPGA еритроцитите, които са адсорбирани, известни със своите специфичност се използват като известен компонент на реакцията антитела - антитяло еритроцит диагностикум. Ако тестовият материал съдържа достатъчно количество от известен антиген, RPGA ще бъде положителен.
Възможностите за използване на RPHA са: реакция на неутрализация на антигена (RNAg), реакция на неутрализация на антитела (RNAb), реакция на инхибиране на пасивната хемаглутинация (PHA). За тези реакции се използва еритроцитна диагностика на антигени и антитела. Две взаимно контролиращи се еднопосочни реакции могат да се използват едновременно, например RPHA с антигенен диагностикум и RNAg с антитяло еритроцитен диагностикум.
Реакцията на неутрализация на антитела (RNAb) се състои от смесване на суспензия, съдържаща желания антиген със специфичен имунен серум, съдържащ известни антитела в подходящи обеми и инкубиране при 37 °C в продължение на два часа. След това се добавя антигенен еритроцитен диагностикум. Сместа се разклаща и се оставя на стайна температура. Резултатите се вземат предвид след 3-4 часа и накрая след 18-24 часа.Ако тестовият материал съдържа антиген, той ще свърже антителата (неутрализира ги) и следователно няма да настъпи хемаглутинация.
Реакцията на неутрализация на антиген (RNAg) се извършва по същия принцип. Само в този случай се откриват антитела в тестовия материал. Специфичен антиген, добавен към такъв тестов материал, ще се свърже с антителата, съдържащи се в него, т.е. ще настъпи неутрализиране на антигена от антитела и следователно няма да настъпи хемаглутинация при добавяне на антитяло еритроцитна диагностика.
Реакция на коаглутинация. Това е един от вариантите за пасивна, т.е. ускорена реакция на аглутинация върху стъкло, медиирана от клетки, носители на антитела. Тази реакция се основава на уникален имот Стафилококус ауреус, който съдържа протеин А в клетъчната си стена, се свързва с Fc фрагментите на IgG и IgM. В този случай активните центрове на антителата остават свободни и могат да взаимодействат със специфични детерминанти на антигени. Капка от 2% суспензия на стафилококи, сенсибилизирани с подходящи антитела, се нанася върху предметно стъкло и се добавя капка суспензия от изследваната бактерия. Ако антигенът съвпада с антителата, в рамките на 30-60 s настъпва ясна аглутинация на заредените с антитела стафилококи.
Реакция на латекс аглутинация (LAR). Носителят на антителата в тази диагностична система са малки стандартни латексови частици. Реакцията се извършва по микрометод в ямки върху стъкло. Основното условие за успешно стадиране на ПАХ е стриктното спазване на количествените съотношения на компонентите на системата: 10 μl латексов препарат, сенсибилизиран с антитела, се добавя към 50 μl от тестовия материал. Специфичността на ПАХ се контролира с помощта на три контролни теста, съдържащи се в търговските тестови системи: известни положителна реакция, очевидно отрицателна реакцияи качествен контрол на латексната суспензия, като се използват нечувствителни към PAH (неносещи антитела) латекси с тестовия материал. У нас като носители на специфични антитела се използват полистиролови монодисперсни латекси с различен диаметър на частиците (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG се използва за бързо откриване на микроорганизми или техните антигени в тестовия материал.
Имуномагнитно откриване на антигени. Един от вариантите за ускорена реакция на аглутинация върху стъкло е свързан с използването на супермагнитни полимерни частици, покрити със специфични антитела. Една такава частица свързва до 107-108 клетки от микроорганизми, поради което чувствителността този методдостига 5 CFU/ml. Имуномагнитното откриване на микроорганизми може да се използва в комбинация с CPR.
Реакция на агрегатна хемаглутинация (AHA). Позволява ви бързо да откриете в кръвта на пациенти както свободно циркулиращи антигени (антигенемия), така и антигени, свързани с антитела - циркулиращи имунни комплекси (CIC). За RAHA се използват червени кръвни клетки, сенсибилизирани с подходящи антитела. Добавянето на кръвен серум на пациента, който съдържа антигени, към сенсибилизирани еритроцити, върху които са фиксирани антитела, води до слепване (аглутинация) на еритроцити и имунни комплекси.
Антиглобулинов тест на Coombs (реакция на R. Coombs). Пълните (двувалентни) антитела се определят чрез директни и пасивни реакции на аглутинация. Непълните (едновалентни, блокиращи) антитела не се откриват с тези методи, тъй като, когато се комбинират с антигена, те го блокират, но не могат да причинят агрегация на антигена в големи конгломерати. Непълни (блокиращи) антитела са тези, при които функционира само един активен център; вторият активен център не работи по неизвестна причина. За откриване на непълни антитела се използва специална реакция на Coombs (фиг. 72). Реакцията включва: серум на пациента, в който непълни антитела, corpuscular antigen-diagnosticum, антиглобулинов серум, съдържащ антитела срещу човешки глобулин. Реакцията протича на два етапа:
Взаимодействие на антиген с непълни антитела. Няма видими прояви. Първият етап завършва чрез измиване на антигена от останалия серум на пациента.
Взаимодействие на антиглобулинов серум, получен в резултат на имунизация на животно с човешки глобулин с непълни антитела, адсорбирани върху антигена. Поради факта, че антиглобулиновите антитела са двувалентни, те свързват две моновалентни антитела от отделни комплекси от антиген + непълно антитяло, което води до тяхното слепване и появата на видима утайка.
13.1. Реакции антиген-антитяло и техните приложения
Когато се въведе антиген, в тялото се образуват антитела. Антителата са комплементарни на антигена, който е причинил техния синтез и могат да се свързват с него. Свързването на антигени с антитела се състои от две фази. Първата фаза е специфична, при която настъпва бързо свързване на антигенната детерминанта към активния център на Fab фрагмента на антителата. Трябва да се отбележи, че свързването се дължи на ван дер Ваалсови сили, водородни и хидрофобни взаимодействия. Силата на връзката се определя от степента на пространствено съответствие между активния център на антитялото и епитопа на антигена. След специфичната фаза започва по-бавна фаза - неспецифична, която се проявява с видим физичен феномен (например образуване на люспи при аглутинация и др.).
Имунните реакции са взаимодействия между антитела и антигени и тези реакции са специфични и силно чувствителни. Те се използват широко в медицинска практика. С помощта на имунните реакции могат да бъдат решени следните проблеми:
Определяне на неизвестни антитела чрез известни антигени (антигенен диагностикум). Тази задача възниква, когато е необходимо да се определят антитела срещу патоген в кръвния серум на пациента (серодиагностика). Намирането на антитела ви позволява да потвърдите диагнозата;
Определяне на неизвестни антигени с помощта на известни антитела (диагностичен серум). Това изследване се провежда при идентифициране на патогенна култура, изолирана от материал на пациента (серотипиране), както и при откриване
микробни антигени и техните токсини в кръвта и други биологични течности. Има много видове имунни реакции, които се различават по техниката на стадиране и регистрирания ефект. Това са реакции на аглутинация (RA), реакции на утаяване (RP), реакции с участието на комплемент (RSC), реакции с използване на белязани компоненти (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Реакция на аглутинация
Реакцията на аглутинация (RA) е имунна реакция на взаимодействие на антиген с антитела в присъствието на електролити, като антигенът е в корпускуларно състояние (еритроцити, бактерии, латексни частици с адсорбирани антигени). По време на аглутинацията корпускулните антигени се залепват заедно с антитела, което се проявява чрез образуване на флокулентна утайка. Образуването на люспи се дължи на факта, че антителата имат два активни центъра, а антигените са поливалентни, т.е. имат няколко антигенни детерминанти. RA се използва за идентифициране на патогена, изолиран от материала на пациента, както и за откриване на антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента (например реакциите на Wright и Heddleson за бруцелоза, реакцията на Widal за коремен тиф и паратиф).
Най-простият начин за диагностициране на RA е реакцията върху стъкло; това е приблизителна RA, която се използва за определяне на патогена, изолиран от пациента. При установяване на реакция върху предметно стъкло се нанася диагностичен аглутиниращ серум (в разреждане 1:10 или 1:20), след което се добавя култура от пациента. Реакцията е положителна, ако в капката се появи флокулентна утайка. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Ако диагностичният аглутиниращ серум не е адсорбиран 1, тогава той се разрежда (до титъра - разреждането, до което трябва да настъпи аглутинация), т.е. поставете разширен RA в епруветки с увеличаване
1 Неадсорбираният аглутиниращ серум може да аглутинира свързани бактерии, които имат общи (кръстосано реагиращи) антигени. Затова използватадсорбирани аглутиниращи серуми, от които кръстосано реагиращите антитела са били отстранени чрез адсорбция към сродни бактерии. Такива серуми задържат антитела, които са специфични само за дадена бактерия.
разреждания на аглутиниращ серум, към който се добавят 2-3 капки суспензия на изолирания от пациента патоген. Аглутинацията се отчита от количеството на утайката и степента на избистряне на течността в епруветките. Реакцията се счита за положителна, ако се наблюдава аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. Реакцията е придружена от контроли: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
За определяне на антитела срещу патогена в кръвния серум на пациента се използва пълномащабен RA. При настройването му кръвният серум на пациента се разрежда в епруветки и към епруветките се добавя равно количество суспензия на диагностикум (суспензия на убити микроби). След инкубацията се определя най-високото серумно разреждане, при което е настъпила аглутинация, т.е. се е образувала утайка (серумен титър). В този случай реакцията на аглутинация с O-diagnosticum (бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилния O-антиген) се проявява под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалдехид, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е груба и протича по-бързо.
Индиректна (пасивна) реакция на хемаглутинация(RNGA или RPGA) е вид RA. Този метод е много чувствителен. С помощта на RNGA могат да бъдат решени два проблема: да се определят антитела в кръвния серум на пациента, към който се добавя антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити, върху които са адсорбирани известни антигени; определяне на наличието на антигени в тестовия материал. В този случай реакцията понякога се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация (RONHA). По време на процедурата към изследвания материал се добавя еритроцитен диагностикум с антитела (еритроцити с адсорбирани на повърхността им антитела). При тази реакция червените кръвни клетки действат като носители и участват пасивно в образуването на имунни агрегати. При положителна реакция пасивно залепените червени кръвни клетки покриват дъното на дупката в равномерен слой с назъбени ръбове („чадър“); при липса на аглутинация червените кръвни клетки се натрупват в централната вдлъбнатина на дупката, образувайки компактен „бутон“ с рязко дефинирани ръбове.
Реакция на коаглутинацияизползвани за определяне на патогенни клетки (антигени), като се използват антитела, адсорбирани върху Стафилококус ауреус,съдържащ протеин А. Протеин А има афинитет към Fc фрагмента на имуноглобулините. Благодарение на това антителата се свързват със стафилокока индиректно чрез Fc фрагмента, а Fab фрагментите са ориентирани навън и могат да взаимодействат със съответните микроби, изолирани от пациенти. В този случай се образуват люспи.
Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HAI)използвани при диагностицирането на вирусни инфекции и само инфекции, причинени от хемаглутиниращи вируси. Тези вируси съдържат протеин на повърхността си - хемаглутинин, който е отговорен за реакцията на хемаглутинация (HRA), когато червените кръвни клетки се добавят към вирусите. RTGA включва блокиране на вирусни антигени с антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки.
Реакция на Кумбс -РА за определяне на непълни антитела. При някои инфекциозни заболявания, като бруцелоза, в кръвния серум на пациента циркулират непълни антитела срещу патогена. Непълните антитела се наричат блокиращи антитела, защото имат едно антиген-свързващо място, а не две, както пълните антитела. Следователно, когато се добави антигенен диагностикум, непълните антитела се свързват с антигени, но не ги слепват. За проява на реакцията се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което ще доведе до аглутинация на имунни комплекси (антигенен диагностикум + непълни антитела), образувани в първия етап на реакцията.
Индиректната реакция на Кумбс се използва при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват непълни моновалентни анти-резус антитела. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Следователно към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум, което предизвиква аглутинация на еритроцитите. Тестът на Coombs се използва за диагностициране патологични състояния, свързани с интраваскуларен лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новородени, причинена от Rh конфликт.
RA за определяне на кръвни груписе основава на аглутинацията на еритроцитите от имунни серумни антитела към антигените на кръвната група A(II), B(III). Контролата е серум, който не съдържа антитела, т.е. серум AB(IV) кръвна група и еритроцитни антигени от групи A(P) и B(III). Червените кръвни клетки от група 0(I) се използват като отрицателна контрола, тъй като те нямат антигени.
За определяне на Rh фактора се използват анти-Rh серуми (поне две различни серии). Ако върху мембраната на изследваните еритроцити има Rh антиген, настъпва аглутинация на тези клетки.
13.3. Реакция на утаяване
RP е имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени в присъствието на електролити, а антигенът е в разтворимо състояние. По време на утаяването разтворимите антигени се утаяват от антитела, което се проявява чрез помътняване под формата на преципитационни ленти. Образуването на видима утайка се наблюдава, когато двата реагента се смесват в еквивалентни съотношения. Излишъкът на един от тях намалява броя на утаените имунни комплекси. Има различни начини за извършване на реакцията на утаяване.
Реакция на пръстеновидно утаяванепоставени в утаителни тръби с малък диаметър. Имунният серум се добавя към епруветката и разтворимият антиген се наслоява внимателно. Ако резултатът е положителен, на границата на двата разтвора се образува млечен пръстен. Реакцията на пръстеновидно утаяване, която се използва за определяне наличието на антигени в органи и тъкани, екстрактите от които се варят и филтрират, се нарича реакция на термопреципитация (реакция на Асколи за определяне на термостабилен антраксен антиген).
Реакция на двойна имунодифузия на Ouchterlony.Тази реакция се провежда в агар гел. В слой от гел с еднаква дебелина се изрязват ямки на определено разстояние една от друга и се пълнят съответно с антиген и имунен серум. След това антигените и антителата дифундират в гела, срещат се и образуват имунни комплекси, които се утаяват в гела и стават видими като прецизни линии.
хранене. Тази реакция може да се използва за идентифициране на неизвестни антигени или антитела, както и за тестване на сходството между различни антигени: ако антигените са идентични, линиите на утаяване се сливат, ако антигените не са идентични, линиите на утаяване се пресичат, ако антигените са частично идентични, образува се шпора.
Реакция на радиална имунодифузия.В разтопеното агар гелДобавят се антитела и гелът се нанася на равномерен слой върху стъклото. В гела се изрязват ямки и към тях се добавя стандартен обем антигенни разтвори с различна концентрация. По време на инкубацията антигените дифундират радиално от ямката и при среща с антитела образуват преципитационен пръстен. Докато излишъкът от антиген остава в ямката, настъпва постепенно увеличаване на диаметъра на преципитационния пръстен. Този метод се използва за определяне на антигени или антитела в тестовия разтвор (например за определяне на концентрацията на имуноглобулини от различни класове в кръвния серум).
Имуноелектрофореза.Антигенната смес първо се разделя електрофоретично, след което се добавя утаяващ антисерум към жлеба, минаващ по посока на движение на протеина. Антигените и антителата дифундират в гела един към друг; взаимодействайки, те образуват дъгообразни валежни линии.
Реакция на флокулация(според Ramon) - вид реакция на утаяване, която се използва за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид. Реакцията се провежда в епруветки. В епруветка, където токсоидът и антитоксинът са в еквивалентно съотношение, се наблюдава мътност.
13.4. Реакция на фиксиране на комплемента
Антителата, взаимодействайки със съответния антиген, свързват добавения комплемент (1-ва система). Индикатор за фиксиране на комплемента са еритроцитите, сенсибилизирани с хемолитичен серум, т.е. антитела към червените кръвни клетки (2-ра система). Ако комплементът не е фиксиран в 1-ва система, т.е. Ако реакцията антиген-антитяло не настъпи, сенсибилизираните червени кръвни клетки са напълно лизирани (отрицателна реакция). Когато комплементът се фиксира от имунни комплекси на 1-ва система след добавяне на сенсибилизирани еритроцити, хемолиза от
отсъства (положителна реакция). Реакцията на свързване на комплемента се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания (гонорея, сифилис, грип и др.).
13.5. Реакция на неутрализация
Микробите и техните токсини имат увреждащ ефект върху органите и тъканите на човешкото тяло. Антителата са способни да се свързват с тези увреждащи агенти и да ги блокират, т.е. неутрализирам. Въз основа на тази характеристика на антителата диагностичен отговорнеутрализиране. Извършва се чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). Например, за откриване на токсини в материала на пациент, животните от 1-ва група се инжектират с материал от пациента. Животните от 2-ра група се инжектират с подобен материал, предварително обработен със съответния антисерум. Животните от 1-ва група умират, ако в материала има токсин. Втората група животни оцелява, увреждащото действие на токсина не се проявява, тъй като се неутрализира.
13.6. Реакции с използване на маркирани антитела или антигени
13.6.1. Имунофлуоресцентна реакция (RIF, метод на Кунс)
Този метод се използва за експресна диагностика. Може да се използва за откриване както на микробни антигени, така и на антитела.
Директен RIF метод- имунна реакция на взаимодействие на антитела с антигени, като антителата са белязани с флуорохром - вещество, способно да излъчва светлинни кванти с определена дължина на вълната, когато е изложено на светлина с определена дължина на вълната. Особеността на този метод е необходимостта от отстраняване на нереагиралите компоненти, за да се изключи откриването на неспецифична луминесценция. За да направите това, измийте нереагиралите антитела. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в намазка, обработена с такъв луминесцентен серум, светят на тъмен фон по периферията на клетката.
Индиректен RIF методсе използва по-често от предишния. Тази реакция се провежда на два етапа. На първия етап антигените взаимно
взаимодействат със съответните антитела, образувайки имунни комплекси. Всички компоненти, които не са реагирали (т.е. не са част от имунни комплекси), трябва да бъдат отстранени чрез измиване. На втория етап полученият комплекс антиген-антитяло се открива с помощта на флуорохромиран антиглобулинов серум. В резултат на това се образува комплекс от микроб + антимикробни заешки антитела + антитела към заешки имуноглобулини, маркирани с флуорохром. Резултатите се оценяват с помощта на флуоресцентен микроскоп.
13.6.2. Ензимен имуносорбентен метод или анализ
ELISA - най-често срещаният модерен метод, използвани за диагностика на вирусни, бактериални, протозойни инфекции, по-специално за диагностика на HIV инфекция, вирусен хепатити т.н.
Има много модификации на ELISA. Твърдофазовият неконкурентен ELISA се използва широко. Провежда се в 96-ямкови полистиренови плаки (твърда фаза). При провеждане на реакция е необходимо да се измият нереагиралите компоненти на всеки етап. При определяне на антитела, тестовият кръвен серум се добавя към ямките, върху които са сорбирани антигени, след това антиглобулинов серум, маркиран с ензим. Реакцията се провежда чрез добавяне на субстрат за ензима. В присъствието на ензим, субстратът се променя и ензим-субстратният комплекс се избира така, че продуктът, образуван в реакцията, да бъде оцветен. Така при положителна реакция се наблюдава промяна в цвета на разтвора. За да се определят антигените, твърдофазният носител се сенсибилизира с антитела, след което последователно се добавят тестовият материал (антигени) и ензимно-белязан серум към антигените. За протичане на реакцията се добавя субстрат за ензима. При положителна реакция настъпва промяна в цвета на разтвора.
13.6.3. Имуноблотинг
Този метод се основава на комбинация от електрофореза и ELISA. При извършване на имуноблотинг (блотинг от английски. петно- петно) сложна смес от антигени първо се подлага на електрофореза в полиакриламиден гел. Полученият фракциониран анти-
генните пептиди се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. След това петната се третират с ензимно белязани антитела срещу специфичен антиген, т.е. извършете ELISA блот. Имуноблотингът се използва при диагностицирането на инфекции като HIV.
13.6.4. Имунна електронна микроскопия
Методът включва микроскопиране на вируси (по-рядко други микроби) в електронен микроскоп, предварително обработени с подходящ имунен серум, белязан с електронно-оптично плътни препарати, например феритин, желязосъдържащ протеин.
13.7. Поточна цитометрия
Кръвните клетки се диференцират въз основа на лазерна цитофлуорометрия. За да направите това, желаните клетки се оцветяват с флуоресцентни моноклонални антитела срещу CD антигени. Кръвната проба, след като е обработена с белязани антитела, преминава през тънка тръбичка и през нея преминава лазерен лъч, който възбужда флуорохрома да свети. Интензитетът на флуоресценция корелира с плътността на антигените на клетъчната повърхност и може да бъде количествено измерен с помощта на фотоумножителна тръба. Получените резултати се преобразуват в хистограма.
За определяне се използва поточна цитометрия имунен статус(съдържание на основните популации на лимфоцити, съдържание на вътреклетъчни и извънклетъчни цитокини, функционална активност на NK клетки, фагоцитозна активност и др.).
Подробна реакция на аглутинация (RA). За определяне на AT в кръвния серум на пациента, a екстензивна реакция на аглутинация (RA). За да направите това, към серия от разреждания на кръвен серум се добавя диагностикум - суспензия от убити микроорганизми или частици със сорбиран Ag. Максималното разреждане дава аглутинация Ag се нарича серумен титър.
Видове реакции на аглутинация (RA) за откриване на АТ - кръвен капков тест за туларемия (с диагностикум, приложен към капка кръв и поява на видими белезникави аглутинати) и тест на Хъдълсън за бруцелоза (с диагностикум, оцветен с тинтява виолет, приложен към капка кръв серум).
Приблизителна реакция на аглутинация (RA)
За идентифициране на изолираните микроорганизми, приблизителна RA се поставя върху предметни стъкла. За да направите това, към капка стандартен диагностичен антисерум (разреден 1:10, 1:20) се добавя патогенна култура. Ако резултатът е положителен, се извършва подробна реакция с нарастващи разреждания на антисерума.
реакциясе счита за положителен, ако се наблюдава аглутинация в разреждания, близки до титъра на диагностичния серум.
OAS. Соматични O-Agsса топлоустойчиви и издържат на кипене в продължение на 2 ч. При взаимодействие с АТ образуват дребнозърнести агрегати.
N-Ag. N-Ag (флагелати)са термолабилни и бързо се разграждат при 100 °C, както и под въздействието на етанол. При реакции с H-антисерум, след 2 часа инкубация, се образуват рехави големи люспи (образувани от бактерии, залепнали заедно с флагели).
Ви-Артифоидната бактерия е относително устойчива на топлина (издържа на температури от 60-62 °C за 2 часа); При инкубиране с Vi антисерум се образува финозърнест аглутинат.
Реакции на директна хемаглутинация
Най-простият от тях реакции - аглутинациячервени кръвни клетки или хемаглутинация, използвани за определяне на кръвни групи в системата ABO. За определяне аглутинация(или липса на такъв) използвайте стандартни антисеруми с анти-А и анти-В аглутинини. Реакцията се нарича директна, тъй като изследваните Ag са естествени компоненти на червените кръвни клетки.
Среща се с директна хемаглутинациявирусната хемаглутинация има механизми. Много вируси са способни спонтанно да аглутинират еритроцитите на птици и бозайници; добавянето им към суспензия от еритроцити предизвиква образуването на агрегати от тях.
