Основава се на факта, че червените кръвни клетки, върху които предварително са адсорбирани антигени, придобиват способността да аглутинират в присъствието на хомоложни серуми (антитела).

В този случай червените кръвни клетки действат като носители със специфични детерминанти, чиято аглутинация възниква в резултат на реакцията антиген + антитяло.

Червените кръвни клетки, към повърхността на които антигените са здраво прикрепени, се наричат диагностикум на еритроцитен антиген или еритроцити, сенсибилизирани с антиген.

Друг вид RNGA - антителата се адсорбират върху повърхността на еритроцитите и последващата им аглутинация се извършва в присъствието на хомоложен антиген. В този случай такива еритроцити се наричат диагностикум на еритроцитни антитела или еритроцити, сенсибилизирани от антитела.

Въз основа на тези два основни методологични подхода са разработени и използвани много модификации на RNGA. Така като носители се използват малки стандартни частици латекс. В този случай реакцията се нарича реакция на латексна аглутинация (RLA) или се използва Стафилококус ауреус- реакция на коаглутинация и др. Обикновено еритроцитните диагностикуми се приготвят в предприятията на биологичната промишленост, а основният опит на RNGA се извършва в диагностични лаборатории.

Приготвянето на еритроцитна диагностика включва следните стъпки:

фиксиране на червени кръвни клетки с формалдехид или глутарови или акрилови алдехиди. Така обработените червени кръвни клетки се съхраняват дълго време. По-често за целта се използват еритроцити от овце, хора, кокоши и др.;
третиране на фиксирани еритроцити с разтвор на танин. В резултат на това червените кръвни клетки придобиват способността необратимо да адсорбират протеини (вируси и антитела) на повърхността си;
сенсибилизация на танизирани еритроцити от вируси или антитела.

Трябва да се отбележи, че методите за приготвяне на еритроцитни диагностикуми за вирусни инфекцииразличен.

Процедурата за извършване на RNGA за откриване и определяне на титъра на антитялото е както следва:

равни дози еритроцити, сенсибилизирани с антиген, се добавят към последователни 2-кратни разреждания на серум;
сместа се оставя за 2-3 часа при стайна температура или за 16-18 часа при 4 °C;
вземете предвид резултатите. Ако серумът съдържа антитела срещу вируса, с който са сенсибилизирани червените кръвни клетки, се наблюдава хемаглутинация, която се оценява в кръстове.

Титърът на антитялото в серума се приема за най-високото разреждане на серума, което все още осигурява хемаглутинация чрез най-малко две кръстосвания.

RNGA се придружава от всички съответни контроли. Обикновено реакцията се провежда с помощта на микрометод.

RNGA ви позволява да разрешите следните диагностични проблеми:

откриване на антитела и определяне на техния титър в кръвния серум с помощта на известен диагностикум на еритроцитния антиген;
откриване и идентифициране на непознат вирус чрез диагностика на известни еритроцитни антитела.

Предимства на RNGA: висока чувствителност, простота на техниката на поставяне и скорост на реакция. Важно е обаче да се отбележи, че възникват големи трудности при подготовката на стабилна диагностика на еритроцитите (голяма зависимост от чистотата на използваните компоненти, необходимостта от избор на режим на фиксация, танизация и сенсибилизация на еритроцитите за всеки тип вирус).

RTGA принципсе състои от смесване на равни обеми кръвен серум и вирусна суспензия в епруветка и след експозиция определяне дали вирусът остава в сместа чрез добавяне на суспензия от червени кръвни клетки. Аглутинацията на еритроцитите показва наличието, а липсата на хемаглутинация показва липсата на вирус в сместа. Изчезването на вируса от сместа вирус + серум се счита за признак на взаимодействие между серумните антитела и вируса.

Но антителата взаимодействат с антигените в строго определени количествени съотношения. Следователно, за да може определено количество от вируса да бъде лишено от неговата хемаглутинираща способност, е необходим определен минимум антитела и тъй като един от компонентите на RTHA винаги е неизвестен, реакцията трябва да бъде поставена в серия от епруветки с различни дози антитела и еднакви дози вирус или обратното. Това се постига чрез вземане или на различни разреждания на серума и същото разреждане на вируса, или на различни разреждания на вируса и същото разреждане на серума.

RTGA ви позволява да решите следните проблеми: определяне на титъра на антителата срещу хемаглутиниращия вирус в серума; идентифициране на неизвестен хемаглутиниращ вирус от известни серуми; установяване на степента на антигенно родство на двата вируса.

Предимства на RTGA:простота на техниката, скорост, не е необходима стерилна работа, специфичност, ниска цена. Недостатък: RTGA е възможна само с хемаглутиниращи вируси.

Принципът на титруване на антитела в RTGAе както следва:

– пригответе серия от последователни (обикновено 2-кратни) разреждания на тестовия серум в равни обеми (обикновено 0,25 или 0,2 ml);

– към всяко разреждане се добавят същите обеми хомоложен вирус в титър 4 HAE;

– смесите се запазват определено времепри определена температура (за вируса на нюкасълската болест 40–60 минути при стайна температура);

– към всички смеси се добавят равни обеми 1% суспензия от промити еритроцити;

– след експозиция, хемаглутинацията във всяка смес се оценява в кръстове.

Реакцията включва контроли на серум, вирус и червени кръвни клетки.

Най-високото серумно разреждане, което все още напълно инхибира хемаглутинацията, се приема като индикатор за титъра на антитялото в този серум.

Използване на реакцията на хемадсорбция във вирусологията.

RGAd.Хемадсорбцията - връзката на еритроцитите с повърхността на клетките, засегнати от вируса - е открита за първи път от Vogel и Shchelokov (1957) върху тъканна култура, заразена с грипния вирус. Това явление се основава на афинитета на рецепторите на вируса, разположени на повърхността на засегнатата клетка, с рецепторите на еритроцитите, което води до тяхното взаимно слепване, подобно на реакцията на хемаглутинация. Предимството на тази реакция е, че тя става положителна дори преди появата на отчетливи цитопатични промени в заразените клетки.

RGAd техникае както следва. На 3-4-ия ден след заразяването на клетките се вземат две епруветки със същата клетъчна култура, едната от които е заразена с вируссъдържащ материал, а втората е контролна. Културалната течност се отцежда от двете епруветки и в двете се добавят по 2-3 капки 0,5% суспензия от промити еритроцити. И двете епруветки се оставят за 5-10 минути, така че червените кръвни клетки да са на повърхността на клетките (поставени хоризонтално на масата), след което леко се изплакват с физиологичен разтвор и се изследват под микроскоп (малко увеличение). В контролната епруветка червените кръвни клетки са напълно отстранени с физиологичния разтвор, а някои от останалите изплуват заедно с течността. Ако червените кръвни клетки в заразената тръба не са били отстранени с физиологичен разтвор и не плават, а са прикрепени към повърхността на клетките, RGAd трябва да се счита за положителен.

В зависимост от вируса и вида на клетката, подреждането на червените кръвни клетки може да бъде три:

– червените кръвни клетки се адсорбират само по периферията на клетъчния слой под формата на „огърлица” (вирус на африканска чума по свинете);

– червените кръвни клетки са разположени върху клетъчния слой във фокуси или клъстери (грипен вирус);

– червените кръвни клетки са разположени дифузно върху клетъчния слой (парагрипен вирус).

Всеки вирус е способен да адсорбира червените кръвни клетки на определени видове животни.

Серологична диагностика на вирусни заболявания чрез повишаване на титъра на антителата в сдвоени кръвни серуми.

Реакция на хемаглутинация (HRA) и реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HIR), механизъм, компоненти и приложение на реакциите.

Реакцията на хемаглутинация се основава на феномена на слепване на червените кръвни клетки, който възниква под въздействието на различни фактори. Има директна и индиректна хемаглутинация.

Първо, червените кръвни клетки се промиват с изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това, ако е необходимо (при използване на протеинови антигени), те се третират с разтвор на танин 1: 20 000 и се сенсибилизират с разтворими антигени. След промиване с буфериран изотоничен разтвор на натриев хлорид еритроцитният антиген е готов за употреба.

Тестовите серуми се разреждат с изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки или специални пластмасови плочи с ямки, след което към всяко разреждане на серума се добавя еритроцитна диагностика. Резултати от реакцията индиректна хемаглутинациявзети предвид от естеството на утайката на червените кръвни клетки, образувана на дъното на епруветката. Резултатът от реакцията, при който червените кръвни клетки покриват равномерно цялото дъно на епруветката, се счита за положителен. В случай на отрицателна реакция червените кръвни клетки под формата на малък диск или „копче“ се намират в центъра на дъното на епруветката

Основни компоненти на RP:

А) разтворим антиген,

B) Специфични антитела (серум)

(RTGA) е метод за идентифициране на вирус или откриване на антивирусни антитела в кръвния серум на пациента, базиран на феномена на липсата на аглутинация на червените кръвни клетки от лекарство, съдържащо вирус, в присъствието на кръвен серум, имунитет срещу него.
се основава на блокада, потискане на вирусни антигени от имунни серумни антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки.

RTGA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грипни вируси, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.
Механизъм.Типизирането на вируса се извършва с помощта на реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HAI) с набор от специфични за типа серуми. Резултатите от реакцията се вземат предвид при липса на хемаглутинация. Подтипове на вирус А с антигени H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и др.

могат да бъдат диференцирани в RTGA с набор от хомоложни тип-специфични серуми.

В основата реакции на хемаглутинация се крие феноменът на адхезия на червените кръвни клетки, който възниква под въздействието на различни фактори.

Има директна и индиректна хемаглутинация.
При реакцията на директна хемаглутинация червените кръвни клетки се слепват, когато определени антигени, като вируси, се адсорбират върху тях.
При серологичните изследвания се използва директна реакция на инхибиране на хемаглутинацията, когато вирусът, изолиран от пациент, се неутрализира със специфичен имунен серум и след това се комбинира с червени кръвни клетки.

Липсата на хемаглутинация показва консистенцията на вируса и използвания имунен серум.

Реакцията на индиректна хемаглутинация (пасивна хемаглутинация) се наблюдава в случаите, когато имунен серум или серум на пациента, съдържащ подходящи антитела, се добавя към червените кръвни клетки, които преди това са били третирани (сенсибилизирани) с различни антигени.

Възниква специфично залепване на червените кръвни клетки, тяхната пасивна хемаглутинация.

Реакцията на индиректна или пасивна хемаглутинация превъзхожда по чувствителност и специфичност други серологични методи и се използва при диагностицирането на инфекции, причинени от бактерии, рикетсии и протозои.

Методът за провеждане на реакция на индиректна хемаглутинация се състои от няколко етапа.

След промиване с буфериран изотоничен разтвор на натриев хлорид еритроцитният антиген е готов за употреба. Тестовите серуми се разреждат с изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки или специални пластмасови плочи с ямки, след което към всяко разреждане на серума се добавя еритроцитна диагностика.

Резултатите от реакцията на индиректна хемаглутинация се вземат предвид от естеството на утайката на червените кръвни клетки, образувана на дъното на епруветката. Резултатът от реакцията, при който червените кръвни клетки покриват равномерно цялото дъно на епруветката, се счита за положителен. При отрицателна реакция червените кръвни клетки под формата на малък диск или „копче“ се намират в центъра на дъното на епруветката.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията- серологична реакция, основана на способността на антителата да предотвратяват аглутинацията на еритроцитите от хемаглутиниращи видове вируси (аденовируси, арбовируси, някои ентеровируси, вируси на грип и параинфлуенца, морбили, реовируси).

Специфични антивирусни антитела взаимодействат с повърхностните хемаглутининови молекули на вирионите на тези вируси и блокират свързването им с комплементарни молекули на еритроцитната мембрана.

IN напоследъкреакцията се използва широко в клиничните вирусологични лаборатории за определяне на титри на специфични антитела към определени вируси, както и за серологична идентификация и типизиране на вирусни изолати от клиничен материал от пациенти.

Използването им е донякъде ограничено поради наличието в човешкия кръвен серум на неспецифични вирусни инхибитори, както и естествени антитела - аглутинини.

Реакцията на неутрализация е реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (HAI).

RTGA се използва:
-за серотипиране на вируси;
-за серодиагностика на инфекции.
Има два метода за настройка:
- капков метод върху стъкло ( показателна реакция), използвани за серокопиране на вируси;
- разширени в епруветки.

Механизъм.

Някои вируси (като грип) имат хемаглутинин, който причинява аглутинация на червените кръвни клетки на различни животни, в зависимост от вида на вируса.

При наличие на антитела - антихемаглутинини - в серума се наблюдава инхибиране на вирусната активност.
RTGA.
Цел: серотипиране на вируса на грип А

Компоненти:
1. Изследваният материал е алантоисната течност на пилешки ембрион,
2. Диагностични антигрипни типоспецифични серуми,
3. 5% суспензия от пилешки еритроцити.
4.

Физиологичен разтвор.

Реакцията се провежда върху стъкло, като се използва капков метод. Нанесете 1 капка диагностичен серум и тестов материал върху стъклото, разбъркайте, след това добавете 1 капка суспензия на червени кръвни клетки. При положителна реакция се наблюдава хомогенно зачервяване, а при отрицателна реакция изпадат червени люспи (хемаглутинация).

Предишен31323334353637383940414243444546Следващ

Характеристики на грипните вируси. Епидемиология и диагностика на грипа. Използване на RTGA за серотипиране на грипни вируси. Препарати за специфична профилактика и лечение.

Грип или инфлуенца - остър инфекция, характеризиращ се с увреждане на лигавиците на горната респираторен тракт, треска, обща интоксикация, нарушаване на сърдечно-съдовата и нервната система.

Грипът е склонен към епидемично и пандемично разпространение поради високата заразност и изменчивостта на патогена.

Характеристики на патогените. Патогените - грипните вируси принадлежат към семейството. Orthomyxoviridae, родове Influenzavirus A, B и Influenzavirus C. Грипните вируси са РНК вируси. Грипният вирус тип А е изолиран през 1933 г. от W. Smith, K. Andrews и P. Laidlaw. През 1940 г. Т.

Приложение на метода на хемаглутинацията във вирусологията.

Франсис и Р. Магил изолират грипни вируси от тип В, през 1949 г. Р. Тейлър - тип С. В Русия първите грипни вируси са изолирани през 1936 г. от А. А. Смородинцев и класифицирани като тип А. Морфология. Грипните вируси имат сферична форма (топчеста) - 80 - 120 nm, по-рядко имат нишковидна форма. Състои се от: 1) ядро - нуклеокапсид със спирален тип симетрия (едноверижна линейна "-" верига на РНК + протеинов капсид); 2) базална мембрана- външна липопротеинова мембрана - суперкапсид.

На повърхността на черупката има гликопротеини (под формата на шипове и власинки) от 2 вида: 1) хемаглутинин - насърчава прикрепването към клетъчните рецептори; 2) невраминидаза - насърчава освобождаването на вируса от клетката. Култивиране. За култивиране се използват пилешки ембриони, първични трипсинизирани клетъчни култури и понякога лабораторни животни.

Най-удобният модел е пилешки ембриони 10-12 - дни на възраст. Това ви позволява да получите големи количества от вируса, който е необходим при производството на ваксини и антибактериални лекарства.

Инфекцията се извършва в алонтоичната кухина, в хорион-алонтоичната мембрана, в амниотичната кухина, в амниона. Наличието на вируса в пилешкия ембрион се открива чрез реакция на хемаглутинация. Антигенна структура. Вирусите имат вътрешен антиген - S и повърхностни антигени: НА-хемаглутинин и NA-невраминидаза. S-антигенът е групово специфичен, общ за целия тип, според този антиген грипните вируси се разделят на типове А, В и С. Това е стабилен (непроменлив) антиген, фиксиращ комплемента.

HA и NA антигените са специфични антигени. HA антигенът причинява образуването на вирус-неутрализиращи антитела и адхезията на червените кръвни клетки.

NA антигенът предизвиква образуването на антитела, които частично неутрализират вирусите.

Вирусът тип B е по-малко променлив, докато тип C е силно стабилен.

Токсични свойства. Токсичен ефект на вируса върху тялото ( главоболие, мускулна болка, треска, катарални симптоми) се причинява от вирусни протеини (самата вирусна частица). Това действие е строго специфично и се неутрализира само от имунен серум от съответния тип или подтип или серум на преболедувалите. Съпротива. Грипните вируси са чувствителни към UV лъчи, дезинфектанти (формалин, алкохол, фенол, хлорамин) и разтворители на мазнини.

В течна среда загиват при температура 50 - 60°C за няколко минути. При стайна температура във въздуха вирусите запазват инфекциозни свойства в продължение на няколко часа. Изсушени издържат дълго, а замразени (-70°C) не само издържат дълго време, но и не губят вирулентност.

Възприемчивост на животните. В естествени условия вирусите тип А заразяват хора и животни (засегнати са конете и свинете), докато вирусите тип В и С заразяват само хората. Сред лабораторните животни белите мишки, африканските порове, сирийските хамстери и маймуните са чувствителни към вируси.

Заболяването при животните се характеризира с увреждане на белите дробове, трескаво състояние и може да доведе до смърт на животните. Епидемиология на заболяването. Източникът на инфекцията е болен човек с клинично изразена или асимптоматична форма. Болният човек освобождава вируса в заобикаляща средапри кашляне, говорене, кихане с капки слюнка, слуз, храчки още по време на инкубационния период.

Болният става заразен 24 часа преди появата на основните симптоми и представлява епидемична опасност до 48 часа след изчезването им.

Предавателният механизъм е аерогенен. Пътят на предаване е въздушно-капков. Възприемчивостта на хората към грип е много висока. Всички се разболяват възрастови групи, главно в зимно време. Децата и възрастните хора са най-податливи. Името на заболяването отразява особеностите на епидемиологията: грип от френски. grapper – грабвам, инфлуенца – от итал. Influenza di freddo - влиянието на настинката.

От всички пикантни респираторни заболяваниягрипът е най-разпространеният и сериозно заболяване. Пандемиите и грипните епидемии обхващат до 30-50% или повече от населението глобус, причинявайки огромни щети на здравето и икономиката на страните. Първите описания на грипни епидемии датират от 12-14 век. Появата на пандемии и големи епидемии се причинява от грипния вирус тип А, което се дължи на високата вариабилност на вируса и се свързва с появата на нов подтип в резултат на антигенно изместване.

Между пандемиите се появяват епидемични взривове на всеки 1,5-2 години, което се свързва с антигенен дрейф на вируси. През 1918 г. испанската грипна пандемия (1,5 милиарда души се разболяват, 20 милиона души умират) е причинена от грипния вирус А1.Първоначално регистрирана в Испания, тази пандемия обхваща почти цялото население на Земята; заболяването се характеризира с развитие на изключително тежка хеморагична пневмония с рекордна смъртност (до 1% от всички случаи).

През 1957 г. „азиатската“ пандемия (2 милиарда души се разболяха) беше причинена от нов подтип - подтип А2. През 1968 г. пандемията „Хонконг” (1 милиард души се разболяват) е причинена от новопоявил се подтип – подтип А3. обикновено, нова опциявирусът измества предишния циркулиращ вариант от човешката популация.

Но през 1977 г., след 20-годишно прекъсване, тип А1 неочаквано се „завърна“, което доведе до голяма епидемия. Следователно изместените варианти на грипния вирус продължават да съществуват и на определени интервали могат отново да предизвикат епидемия. Вирус тип B причинява локални епидемии, но тип C не причинява епидемии. Патогенеза и клинична картина на заболяването. Входната врата са горните дихателни пътища. Вирусът прониква в епителните клетки на лигавицата и се размножава в тях.

Ефектът на вируса върху епителните клетки причинява тяхната некроза и десквамация (отхвърляне) на епитела, в резултат на което лигавицата става пропусклива за вируси и бактерии. Те проникват в кръвта и се разпространяват в тялото.” Виремията се придружава от множество лезии на ендотела на капилярите с повишаване на тяхната пропускливост.

IN тежки случаиНаблюдават се обширни кръвоизливи в белите дробове, миокарда и паренхимните органи. Разпадните продукти на увредените клетки и вирусните протеини имат токсичен ефектвърху различни органи и системи от органи. Токсините на вируса силно потискат централната нервна система и въпреки че процесът не продължава дълго (3-5 дни), болният остава отслабен дълго време и към отслабения организъм се присъединява вторична инфекция и възникват усложнения: грипна пневмония , остър белодробен оток, увреждане на бъбреците, сърцето, бронхите.

Често срещано усложнение на грипа е бактериална пневмония(стрептококи от група В). По време на пандемията от испански грип хората умираха главно от вторична бактериална пневмония.

В патогенезата на грипа е важна не само интоксикацията, но и алергизацията, както и нарушение на функционалните свойства на имунокомпетентните клетки с развитието на имунодефицит. Инкубационен период- няколко часа - 1-3 дни. Характеризира се с остро начало, повишаване на температурата до 37,5 - 38 ° C, обща интоксикация, изразяващо се в неразположение, главоболие, болка в очни ябълки, възпалителни процеси на дихателните пътища с различна тежест (ринит, ларингит, трахеит, фарингит).

Фебрилното състояние на грипа без усложнения продължава 5-6 дни. Имунитет. След заболяване се формира типоспецифичен и щамспецифичен имунитет, който се осигурява от специфични и неспецифични клетъчни и хуморални фактори. Голямо значениеимате антитела Ig A. Не се развива кръстосан имунитет, след преболедуване от грип тип А1 може да се разболеете от грип тип А2 и др. След вирус тип В имунитетът продължава 1-2 години, след вирус тип В - 3-5 години.

Пасивен естествен имунитет - при деца под 8 - 11 месеца. Поради високата антигенна вариабилност на вируса, възстановяването не води до развитие на стабилен имунитет към повторни инфекции.

Лабораторна диагностика. Изследван материал: петна-отпечатъци от лигавицата на носната кухина, назофарингеален секрет, парченца бели дробове, мозък при смърт.

Диагностични методи: 1) метод на цитороскопия - откриване на вътреклетъчни включвания, специфични за вируса - при оцветяване с пиоктанин под микроскоп се виждат яркочервени включвания на грипния вирус в клетките на цилиарния епител; 2) вирусологичен метод— изолиране на грипния вирус от човешкото тяло чрез заразяване на пилешки ембриони с тампони от назофаринкса на пациента; индикацията (наличието) на вируса се извършва с помощта на RGA (грипните вируси аглутинират еритроцитите на хора и различни животни), идентифицирането на вируса се извършва на етапи: типът се определя в RSC, подтипът на хемаглутинина се определя в RGA, а подтипът невраминидаза се определя в реакцията на инхибиране на ензимната активност; 3) серологичен метод - откриване на повишаване на титъра (4 пъти) на специфични антитела в кръвния серум на пациента с помощта на RSK, RTGA, RN в клетъчна култура, реакция на утаяване в гел, ELISA; 4) биологичен метод— интраназална инфекция на мишки — инжектиране на материал в белите дробове под етерна анестезия; мишките умират след 2-3 дни в резултат на пневмония; 5) бърза диагностика - откриване на вирусен антиген с помощта на RIF.

Лечение и профилактика.

За профилактика и лечение в първите дни на заболяването се използва човешки левкоцитен интерферон (интраназално). IN лечебни целиизползване антивирусни лекарства- ремантадин (грипен тип А), адапромин, виразол и имуномодулиращи лекарства - дибазол, продигиозан, левамизол.

При тежък грип, особено при деца, се използва донорски противогрипен имуноглобулин, както и лекарства - инхибитори на клетъчните протеази (гордокс, контрикал, аминокапронова киселина).

Специална профилактика. Използват се следните антивирусни препарати и имуномодулатори, както и ваксини – живи и инактивирани: 1) живи моноваксини за перорално приложение – атенюирани щамове на циркулиращи в момента вируси (А1, А3 и В); проявяват най-голяма имуногенност; 2) ваксини с цели вириони от вирулентни щамове, инактивирани от формалдехид или UV лъчи; 3) субединични противогрипни ваксини само от повърхностни антигени - HA и NA антигени (имат минимална реактогенност).

За да се получат ваксини, вирусите се култивират в пилешки ембриони и в клетъчни култури от пилешки ембриони.

При прилагане на ваксини се формира локален и хуморален имунитет. Ваксинирането се извършва в периоди на най-голям риск от епидемии. Показан е най-вече за по-млади и възрастни хора. Използването на убити ваксини изисква годишна реваксинация; тяхната ефективност не надвишава 60 - 70%.

защото Често се наблюдават антигенни вариации на патогена, тогава наборът от антигени на съответния вирус за имунизация може да бъде определен само след началото на огнището на заболяването.

Билет 15.

Реакция на хемаглутинация (HRA).

В лабораторията се използват две реакции на хемаглутинация с различен механизъм на действие.

Първият RGA е серологичен. При тази реакция червените кръвни клетки се аглутинират при взаимодействие с подходящи антитела (хемаглутинини).

Реакцията се използва широко за определяне на кръвни групи.

Вторият RGA не е серологичен. При него слепването на червените кръвни клетки не е причинено от

антитела, но специални вещества, образувани от вируси. Например, грипният вирус аглутинира пилешките червени кръвни клетки и морски свинчета, полиомиелит вирус - овчи червени кръвни клетки. Тази реакция позволява да се прецени наличието на определен вирус в изследвания материал.

Реакцията се провежда в епруветки или в специални плаки с ямки.

Изследваният материал за наличие на вируса се разрежда с изотоничен разтвор от 1:10 до 1:1280; 0,5 ml от всяко разреждане се смесват с равен обем 1-2% суспензия на червени кръвни клетки. В контролата 0,5 ml еритроцити се смесват с 0,5 ml изотоничен разтвор. Епруветките се поставят в термостат за 30 минути, а плаките се оставят на стайна температура за 45 минути.

Отчитане на резултатите.Ако реакцията е положителна, на дъното на епруветката или кладенчето се появява утайка от червени кръвни клетки с назъбени ръбове („чадър“), покриваща цялото дъно на ямката.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията

Ако резултатът е отрицателен, червените кръвни клетки образуват плътна утайка с гладки ръбове („копче“). Същата утайка трябва да бъде в контролата.

Интензивността на реакцията се изразява със знаци "+". Титърът на вируса е максималното разреждане на материала, в който настъпва аглутинация.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията

д. инхибират реакцията на хемаглутинация. Тази реакция ви позволява да определите вида и вида на вирусите.

Настройка на реакция. 0,25 мл антивирусен серумсмесен с равен обем материал, съдържащ вируса. Сместа се разклаща и се поставя в термостат за 30 минути, след което се добавят 0,5 ml 1-2% суспензия на червени кръвни клетки.

Отчитане на резултатите.Ако експериментът е проведен правилно, трябва да се образува "бутон" в контрола на серума и еритроцитите - няма фактор, аглутиниращ еритроцитите; при контрола на антигена се образува "чадър" - вирусът причинява аглутинация на червените кръвни клетки.

Ако серумът е хомоложен на изследвания вирус, се образува "бутон" - серумът е неутрализирал вируса.

Реакция на индиректна хемаглутинация

Индиректната (пасивна) реакция на хемаглутинация (RIHA) се основава на факта, че червените кръвни клетки, ако разтворим антиген е адсорбиран на повърхността им, придобиват способността да аглутинират при взаимодействие с антитела към адсорбирания антиген.

Настройка на реакция.

Серумът се нагрява в продължение на 30 минути при 56 °C, разрежда се последователно в съотношение 1:10 - 1:1280 и се излива в 0,25 ml в епруветки или ямки, където след това се капват 2 капки червени кръвни клетки с адсорбирани върху тях антигени. добавен.

контроли:суспензия от еритроцити с адсорбирани върху тях антигени с очевидно имунен серум, суспензия от еритроцити с адсорбирани върху тях антигени с нормален серум; суспензия от нормални червени кръвни клетки с тест серум.

При първата контрола трябва да настъпи аглутинация, а при втората и третата да не настъпи.

Контролни въпроси.

1. Какво показва положителен резултат от рентгеново изследване между червените кръвни клетки и материала, който се изследва за наличие на вирус?

2. Ще възникне ли реакция на аглутинация на червените кръвни клетки, ако към тях се добави вирус и съответният му серум?

Как се нарича реакцията, която разкрива това явление?

ПРАКТИЧЕСКА РАБОТА № 12.

Реакция на фиксиране на комплемента.

Реакцията на фиксиране на комплемента (FFR) се основава на факта, че специфичен комплекс антиген-антитяло винаги адсорбира (свързва) комплемента към себе си.

Тази реакция се използва широко при идентифициране на антигени и серодиагностика на инфекции, особено заболявания, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.

RKS е сложна серологична реакция.

Включва комплемент и две системи антиген-антитяло. По същество това са две серологични реакции.

Дясната основна система се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не). Към него се добавя известно количество комплемент. Ако антигенът и антитялото на тази система съвпадат, те ще се свържат и ще свържат комплимент. Полученият комплекс е фино диспергиран и невидим.

Образуването на този комплекс се открива с помощта на втора хемолитична или индикаторна система.

Той включва овчи червени кръвни клетки (антиген) и съответния хемолитичен серум (антитела), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизисът на червените кръвни клетки може да настъпи само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система, тогава във втората система няма да има хемолиза, т.к

няма безплатно допълнение. Липсата на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътна или има утайка от еритроцити на дъното) се записва като положителен резултат от RSC.

Ако в първата система антигенът не съответства на антитялото, тогава имунният комплекс няма да се образува и комплементът ще остане свободен. Оставайки свободен, комплиментът участва във втората система, причинявайки хемолиза, резултатът от RSC е отрицателен (съдържанието на тръбите е прозрачно - „лакирана кръв“).

Компоненти, реакции на фиксиране на комплемента:

Антиген - обикновено лизат, екстракт, хаптен,

по-рядко суспензия от микроорганизми.

2. Антитяло - серум на пациента.

3. Комплемент - серум от морско свинче.

Антиген - овчи червени кръвни клетки.

5. Антитяло - хемолизин към овчи еритроцити.

6. Изотоничен разтвор.

Поради факта, че РСК участва голям бройсложни компоненти,

първо трябва да се титруват и да се включат в реакцията в точни количества и равни обеми: 0,5 или 0,25, по-рядко 0,2, 1,25 или 1,0 ml (по-големите обеми дават по-точен резултат). Титруването на реакционните компоненти се извършва в същия обем като експеримента, като липсващите съставки се заместват с изотоничен разтвор.

Свързана информация:

Търсене в сайта:

Друг вид RNGA - антителата се адсорбират върху повърхността на еритроцитите и последващата им аглутинация се извършва в присъствието на хомоложен антиген.

В този случай такива еритроцити се наричат диагностикум на еритроцитни антитела или еритроцити, сенсибилизирани от антитела.

Въз основа на тези два основни методологични подхода са разработени и използвани много модификации на RNGA. Така като носители се използват малки стандартни частици латекс.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (HAI)

В този случай реакцията се нарича реакция на латексна аглутинация (RLA) или се използва Staphylococcus aureus - реакция на коаглутинация и др. Обикновено диагностиката на еритроцитите се приготвя в предприятията на биологичната индустрия, а основният опит на RNGA се извършва в диагностични лаборатории.

Приготвянето на еритроцитна диагностика включва следните стъпки:

фиксиране на червени кръвни клетки с формалдехид или глутарови или акрилови алдехиди.
Така обработените червени кръвни клетки се съхраняват дълго време. По-често за целта се използват еритроцити от овце, хора, кокоши и др.;
третиране на фиксирани еритроцити с разтвор на танин. В резултат на това червените кръвни клетки придобиват способността необратимо да адсорбират протеини (вируси и антитела) на повърхността си;
сенсибилизация на танизирани еритроцити от вируси или антитела.

Трябва да се отбележи, че методите за изготвяне на еритроцитна диагностика за вирусни инфекции са различни.

Процедурата за извършване на RNGA за откриване и определяне на титъра на антитялото е както следва:

равни дози еритроцити, сенсибилизирани с антиген, се добавят към последователни 2-кратни разреждания на серум;
сместа се оставя за 2-3 часа при стайна температура или за 16-18 часа при 4 °C;
вземете предвид резултатите.
Ако серумът съдържа антитела срещу вируса, с който са сенсибилизирани червените кръвни клетки, се наблюдава хемаглутинация, която се оценява в кръстове.

RNGA се придружава от всички съответни контроли. Обикновено реакцията се провежда с помощта на микрометод.

RNGA ви позволява да разрешите следните диагностични проблеми:

откриване на антитела и определяне на техния титър в кръвния серум с помощта на известен диагностикум на еритроцитния антиген;
откриване и идентифициране на непознат вирус чрез диагностика на известни еритроцитни антитела.

Предимства на RNGA: висока чувствителност, простота на техниката на поставяне и скорост на реакция.

Важно е обаче да се отбележи, че възникват големи трудности при подготовката на стабилна диагностика на еритроцитите (голяма зависимост от чистотата на използваните компоненти, необходимостта от избор на режим на фиксация, танизация и сенсибилизация на еритроцитите за всеки тип вирус).

Ако намерите грешка, моля, изберете част от текста и натиснете Ctrl+Enter.

Във връзка с

Съученици

Той използва червени кръвни клетки или неутрални синтетични материали (например латексови частици), върху повърхността на които се сорбират антигени (бактериални, вирусни, тъканни) или антитела.

Тяхната аглутинация възниква, когато се добавят подходящи серуми или антигени. Червените кръвни клетки, сенсибилизирани с антигени, се наричат антигенен еритроцитен диагностикум и се използват за откриване и титриране на антитела. Еритроцити, сенсибилизирани с антитела. се наричат имуноглобулинови еритроцитни диагностикуми и се използват за откриване на антигени.

Реакцията на пасивна хемаглутинация се използва за диагностициране на заболявания, причинени от бактерии (коремен тиф и паратиф, дизентерия, бруцелоза, чума, холера и др.), протозои (малария) и вируси (грип, аденовирусни инфекции, вирусен хепатит B, морбили, енцефалит, пренасян от кърлежи, кримски хеморагична трескаи др.), както и за определяне на някои хормони, идентифициране свръхчувствителностпациент да лекарстваи хормони като пеницилин и инсулин.

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA).

Тестът за пасивна хемаглутинация е чувствителен метод за серологична диагностика и се използва както за ранна, така и за ретроспективна диагностика, както и за определяне на имунологичното състояние на ваксинирани лица. При пациенти с туларемия антителата обикновено се откриват в края на 1-вата или 2-рата седмица на заболяването; след 1-1,5 месеца титрите на RPHA достигат максимални нива (1: 100 000-1: 20 000, по-рядко по-високи), след което те намаление до ниво 1:100-1:200 се съхраняват за дълго време.

При ваксинирани хора антителата също се откриват постоянно, но в по-ниски титри, не надвишаващи 1: 2000-1: 5000 1-1,5 месеца след ваксинацията, и остават в продължение на няколко години на ниско ниво от 1: 20-1: 80.

Антигенът за стадиране на RPHA е tularemia erythrocyte diagnosticum (антигенен).

Лекарството е формалинизирани овчи червени кръвни клетки, сенсибилизирани с туларемичен антиген, налични в течна и суха форма. Течен препарат - 10% суспензия на червени кръвни клетки в разтвор на формалдехид с концентрация 10%. Сухият лиофилизиран препарат представлява вакуумно изсушена 10% суспензия от червени кръвни клетки без консервант. Преди употреба се разрежда според указанията на етикета. За провеждане на реакцията в полистиренови плаки и двете лекарства се използват при концентрация от 2,5%, а при провеждане на реакцията в микрообеми - при концентрация от 0,5%.

Техника за настройка на RPGA.

Тестовите серуми се разреждат физиологичен разтвор 1:5 (1:10) и се нагрява при 56 градуса С в продължение на 30 минути.

Реакция на хемаглутинация (HRA) и

След това, за да се отстранят хетерогенните антитела към овчи еритроцити, серумите се третират с 50% суспензия от формалинизирани овчи еритроцити. За да направите това, добавете червени кръвни клетки в размер на 2 капки (0,05 ml) на 1 ml серум и разбъркайте добре чрез разклащане.

Серумът се оставя до пълното утаяване на еритроцитите или се центрофугира след един час при стайна температура, след което е готов за изследване.

Течността за разреждане се излива в обем от 0,5 ml в редица ямки върху полистиролова плака.

По време на предварителното изследване на серумите е препоръчително да ги тествате, като поставите реакцията в къс ред на плаката (6 ямки). Ако се открият антитела в кратка серия, серумите се тестват повторно в дълга серия от разреждания (12 ямки).

След като разлеете течността за разреждане, добавете 0,5 ml тестови серуми в разреждане 1:5 към първата ямка на всеки ред (къса или дълга). След това същите обеми серум се титруват с двукратни разреждания. Така се получават серумни разреждания в късите серии от 1:10 до 1:320, а в дългите серии от 1:10 до 1:20480. След титруване на серума във всяка ямка се добавя една капка (0,05 ml) от работна 2,5% суспензия от сенсибилизирани еритроцити.

Съдържанието на плочите се разклаща старателно до получаване на хомогенна суспензия. Плочите се оставят на стайна температура върху неподвижна повърхност на масата. Предварителният запис на реакцията се извършва след 2-3 часа, окончателното определяне на титъра се извършва след пълно утаяване на червените кръвни клетки в ямките. За реакцията са осигурени следните контроли: 1) тест серум, разреден 1:10 в обем от 0,5 ml + 1 капка 2,5% суспензия от несенсибилизирани еритроцити; 2) течност за разреждане в обем от 0,5 ml + 1 капка 2,5% суспензия от несесибилизирани еритроцити; 3) течност за разреждане в обем от 0,5 ml + 1 капка 2,5% суспензия от сенсибилизирани еритроцити.

Всички контроли трябва да дават ясно отрицателна реакция.

Отчитане и оценка на РПГА. Реакцията се оценява по следната схема:

1) рязко положителна реакция (++++) - червените кръвни клетки падат на дъното на дупката в равномерен слой под формата на „чадър“, който често има изкривено топене на ръбовете;

2) положителна реакция (+++) - червените кръвни клетки покриват поне 2/3 от дъното на ямката;

3) слабо положителна реакция (++) - аглутинатът е малък и се намира в самия център на ямката;

4) съмнителна реакция (+) - около утайката на еритроцитите в самия център на ямката има отделни зърна аглутинат;

5) отрицателен (-) - на дъното на дупката червените кръвни клетки се установяват под формата на „копче“ или малък пръстен с гладки, рязко дефинирани ръбове.

Серумният титър се взема предвид въз основа на последното разреждане на серума, което дава много ясна реакция (поне три плюса).

Разреждане от 1:100 или по-високо се счита за диагностичен титър, но, както и при RA, е необходимо да се следи неговото повишаване.

RPHA за туларемия е доста специфичен и открива някои кръстосани реакции само с бруцелозни серуми. Диференциална диагнозавъзможно чрез височината на титрите в RPGA, които са значително по-високи с хомоложния антиген.

Техника за настройка на RPHA в микрообеми.

RPGA може да се извърши в микрообеми с помощта на микротитратор тип Takachi (или микроплаки с кръгло дъно с микропипети), което позволява титруване на материал в обеми от 25 μl и 50 μl. Техниката на реакцията и последователността на всички операции са същите като при изследване в полистиренови плочи. Трябва да се има предвид обаче, че чувствителността на микрометода обикновено е едно разреждане (т.е.

2 пъти) по-ниска от макрометода.

За да се настрои реакцията в микротитратор, течност за разреждане в обем от 50 μl се добавя към всяка ямка с помощта на пипета-капкомер. След това, като се използват титратори с глава от 50 μl, тест серумът се събира чрез потапяне на главата в него.

Уверете се, че течността е напълнила главата на титратора. Титраторът със серум се прехвърля в първата ямка и, като се държи във вертикално положение, няколко ротационни движенияотиване и връщане. След това титраторът се прехвърля в следващата ямка и манипулацията се повтаря. Титруването може да се извърши едновременно в няколко реда. След титруване на цялата серия, титраторът се измива с дестилирана вода (смяна на 2 порции) чрез въртеливи движения, водата се отстранява от главата с помощта на тампон и се изгаря на пламък на горелка.

След титруване добавете 25 μl диагностична течност за еритроцити към ямките.

Концентрацията на диагностикума за RPHA в микрообеми трябва да бъде 0,5% (т.е. 2,5% суспензия от червени кръвни клетки се разрежда допълнително 5 пъти). След добавяне на червени кръвни клетки, плаките трябва да се разклатят леко, докато се получи хомогенна суспензия. Резултатите могат да бъдат записани в рамките на 1-1,5 часа, което е значително предимство на RPGA в микротитър.

В допълнение, тази техника изисква малки количества от всички реакционни съставки и тест серуми.

Реакцията се взема предвид по следната схема:

1) "+" - пълна хемаглутинация, при която червените кръвни клетки падат на дъното на ямката в равномерен слой под формата на "чадър", заемащ най-малко 2/3 от дъното;

2) "+-" - частична хемаглутинация, при която червените кръвни клетки падат на дъното под формата на хлабав пръстен с малък размер;

3) "-" - липса на хемаглутинация, когато червените кръвни клетки падат на дъното под формата на малък бутон или пръстен с гладък ръб.

Специфичност положителен резултат, получени в RPHA, могат да бъдат тествани с помощта на трикомпонентна реакция - реакцията на инхибиране на пасивната хемаглутинация (RPHA).

Техника за настройка на RTPGA.

Тази реакция се използва за потвърждаване на специфичността на положителен резултат от RPGA, когато е под съмнение или е от особен епидемиологичен интерес. Механизмът на реакцията е специфичното инхибиране на хемаглутинацията, когато към тестовия серум се добави суспензия от убити туларемични бактерии. Три компонента взаимодействат в реакцията: тестов серум, специфичен туларемичен антиген и антигенен еритроцитен диагностикум RTPHA обикновено се поставя в редица от 7-8 ямки.

Препоръчително е да инсталирате повторен RPGA успоредно с RTPGA. В два реда ямки се налива по 0,25 ml разреждаща течност, след което в първите ямки на двата реда се добавя изпитваният серум в обем 0,25 ml и се извършва титруване.Получават се два еднакви реда серумни разреждания. Добавете 0,25 ml течност за разреждане към всички ямки от втория ред и 0,25 ml суспензия от туларемични бактерии към ямките от първия ред.

Използва се Tularemia diagnosticum (съдържащ 25 милиарда туларемични бактерии в 1 ml), предварително разреден 50 пъти.

Тази суспензия съдържа 500 милиона бактерии в 1 ml или 125 милиона в обем от 0,25 ml. След добавяне на антигена, плаката се оставя за 1 час при стайна температура, след което се добавя една капка (0,05 ml) еритроцитен диагностикум към всички ямки на двата реда, плаката се разклаща и се оставя на равна повърхност на масата.

Счетоводството се извършва след 2-3 часа.

Отчитане и оценка на РТПГА. Ако тестовият серум съдържа специфични антитела срещу туларемия, те се неутрализират от добавения антиген и няма да настъпи хемаглутинация в първия ред ямки или, при висок серумен титър, хемаглутинация ще се наблюдава в по-малък (2-4) брой ямки кладенци, отколкото в реда с RPHA. В този случай специфичността на резултатите беше потвърдена.

Ако се забележи хемаглутинация и в двата реда, т.е. Ако резултатите от RTPGA и RPGA съвпадат, това показва липсата на антитела срещу туларемия в тестовия серум. В този случай първичният резултат от RPGA се счита за неспецифичен.

Техника за стадиране на РТХГ в микрообеми. RTPGA, подобно на RPGA, може да се извърши в микрообеми, като се използва микротитър тип Takachi.

За да направите това, добавете 0,25 μl течност за разреждане в ямките на микроплаките в два реда от по 7-8 ямки всяка. След това с помощта на титратор се добавят 0,25 μl от тестовия серум и се титруват в двата реда. След това към всяка ямка на първия ред се добавят 25 μl туларемичен антиген (концентрацията на който е 500 милиона туларемични бактерии в 1 ml) и 25 μl разреждаща течност се добавят към втория ред.

Плаките се оставят за 1 час при стайна температура, след което към всички ямки от двата реда се добавят 25 μl антигенен зритроцитен диагностикум (0,5% концентрация).

Отчитането и оценката на резултатите се извършват подобно на реакциите в макрообемите.

Дата на публикуване: 2015-02-03; Прочетено: 3176 | Нарушаване на авторските права на страницата

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018 (0,003 s)…

Реакция на Видал. От втората седмица на заболяването в кръвта на пациентите се натрупват антитела срещу инфекциозния агент. За да ги идентифицирате, кръвният серум на пациента се изследва в реакция на аглутинация. Като антигени се използват убити салмонелни култури - диагностикуми.

За извършване на реакцията на Widal се използват серумът на пациента, набор от диагностични комплекти и изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Кръв (2-3 ml) от пулпата на пръста или кубиталната вена се събира в стерилна епруветка и се доставя в лабораторията. В лабораторията епруветката се поставя в термостат за 20-30 минути, за да се образува съсирек, след това с пипета на Пастьор се обикаля съсирека, за да се отдели от стената на епруветката, и се поставя на студено. за 30-40 минути. Отделеният серум се изсмуква и се използва за извършване на реакция на аглутинация с диагностика на салмонела тиф и паратиф. Кръвта може да се центрофугира, за да се получи серум.

Когато и да е инфекциозен процес- коремен тиф или паратиф - организмът произвежда О- и Н-антитела към едни и същи антигени на патогена.

О-антителата се появяват първи и изчезват доста бързо. Н-антителата продължават дълго време. Същото се случва по време на ваксинация, следователно положителна реакция на Widal с О- и Н-антигени показва наличието на заболяването, а реакция само с Н-антигени може да възникне както при тези, които са се възстановили от заболяването (анамнестична реакция), така и ваксинираните (ваксина реакция). Въз основа на това реакцията на Widal се извършва отделно с О- и Н-антигени (диагностикуми).

Тъй като коремният тиф и паратифните трески A и B са клинично сходни, за да се идентифицира естеството на заболяването, серумът на пациента се изследва едновременно с диагностиката на Salmonella typhus и паратиф A и B.

Реакцията на Widal е широко използвана, тъй като е проста и не изисква специални условия.

Реакцията може да се проведе по два начина: капково и обемно (виж глава 12). В практиката по-често се използва обемният метод. При провеждане на реакция на линейна аглутинация броят на редовете трябва да съответства на броя на антигените (диагностикуми). Причинителят на заболяването се счита за микроорганизъм, от който диагностикумът е аглутиниран от серума на пациента. Понякога се отбелязва групова аглутинация, тъй като причинителите на коремен тиф и паратиф имат общи групови антигени. В този случай резултатът от реакцията в серията, в която се отбелязва аглутинация при по-голямо разреждане на серум, се счита за положителен (Таблица 36).

Таблица 36. Възможен резултат от реакцията на аглутинация

Забележка. На практика реакцията на Widal се извършва с четири диагностикума: коремен тиф „О” и „Н” и паратиф А и В с диагностикуми „ON”.

Ако аглутинацията настъпи само при малки разреждания на серума - 1:100, 1:200, тогава, за да се разграничи реакцията по време на заболяването от ваксинационната или анамнестичната реакция, те прибягват до повторение на реакцията на аглутинация след 5-7 дни. При пациент титърът на антителата се повишава, но при ваксиниран или възстановен човек не се променя. По този начин повишаването на титъра на антителата в кръвния серум служи като индикатор за заболяването.

В отговор на въвеждането на тифозни патогени, притежаващи Vi антигена в тялото, Vi аглутинини се появяват в кръвта на пациента. Те се откриват от 2-та седмица на заболяването, но титърът им обикновено не надвишава 1:10. Откриването на Vi-антитела е свързано с наличието на патогени на коремен тиф в организма, поради което определянето на тези антитела е от голямо епидемиологично значение, тъй като позволява идентифицирането на носители на бактерии.

Vi-реакция на хемаглутинация. Това е най-чувствителната реакция за откриване на антитела.

Принципът на реакцията е, че човешки (група I) или овчи еритроцити, след специална обработка, могат да адсорбират Vi-антиген на повърхността си и по този начин да придобият способността да аглутинират със съответните Vi-антитела.

Червените кръвни клетки с антигени, адсорбирани на повърхността, се наричат еритроцитни диагностикуми.

За да извършите реакцията на Vi-хемаглутинация, вземете:

1) кръвен серум на пациента (1-2 ml); 2) еритроцитна Salmonella Vi-diagnosticum; H) Vi-серум; 4) О-серум; 5) изотоничен разтвор на натриев хлорид.

Реакцията се провежда в аглутинационни епруветки или в пластмасови плаки с ямки.

Взема се кръв от пациента по същия начин, както при реакцията на Vidal. Получава се серум. От серума се приготвят двукратни серийни разреждания, като се започне от 1:10 до 1:160.

0,5 ml от всяко разреждане се добавят към ямката и се добавят 0,25 ml еритроцитен диагностикум. Реакцията се провежда в обем от 0,75 ml.

Контролите са: 1) стандартен аглутиниращ монорецепторен серум + диагностикум - реакцията трябва да е положителна до серумния титър; 2) диагностикум в изотоничен разтвор на натриев хлорид (контрола) - реакцията трябва да е отрицателна.

Съдържанието на ямките се смесва старателно, поставя се в термостат за 2 часа и се оставя на стайна температура до следващия ден (18-24 часа).

Счетоводството започва с контрол. Реакцията се оценява в зависимост от степента на аглутинация на диагностикума.

Резултатите се вземат предвид по системата с четири кръста:

Червените кръвни клетки са напълно аглутинирани - утайка на дъното на ямката под формата на "чадър";

+++ "чадърът" е по-малък, не всички червени кръвни клетки са аглутинирани;

++ "чадърът" е малък, на дъното на дупката има утайка от неаглутинирани еритроцити;

Реакцията е отрицателна; червените кръвни клетки не аглутинират и се утаяват на дъното на ямката под формата на копче.

Контролни въпроси

1. В кой период на заболяването се извършва реакцията на Видал?

2. Какви съставки са необходими за извършване на реакцията на Widal?

3. Каква диагностика се използва за провеждане на реакцията на Vidal?

4. Коя серологична реакция е най-чувствителната при диагностицирането на инфекции с тиф и паратиф?

5. Какъв диагностикум се използва при провеждане на реакцията на Vi-хемаглутинация?

6. Какъв серум се използва за определяне на наличието на Vi-антиген в изследваната култура?

7. Какво е значението на определянето на Vi-фаготипа?

Вземете О- и Н-диагностика от Salmonella typhus, паратиф A и паратиф B и серум на пациента от учителя. Дайте реакцията на Видал.

Културни медии

Средите EMS, Ploskireva и бисмут-сулфитният агар се произвеждат от медицинската индустрия под формата на сух прах. Приготвят се според указанията на етикета: претегля се определено количество прах, залива се с необходимото количество вода, кипва се и се изсипва в стерилни петриеви панички.

Ръсел Уензди. Добавете 40 g суха хранителна среда към 950 ml дестилирана вода и добавете 5 g хранителен агар. Загрейте, докато заври и праховете се разтворят. 1 g х се разтваря в 50 ml дестилирана вода. ч. глюкоза и добавете към готовата смес. Средата се налива в стерилни епруветки от 5-7 ml, стерилизира се с течаща пара (2 дни по 2 минути) и се скосява така, че да остане колона. По същия начин се приготвя среда на Ръсел с манитол и захароза.

Среда на Olkenitsky от сух агар. 2,5 g сух хранителен агар се разтопяват в 100 ml дестилирана вода. Към охладения до 50°C агар се добавят всички съставки посочени в рецептата (на етикета). Средата, излята в епруветки, се стерилизира с течаща пара (3 дни, 20 минути всеки) и след това се коси. Приготвената среда трябва да е бледорозова на цвят.

Реакция на инхибиране на хемаглутинацията

Реакция на хемаглутинация

Реакция на аглутинация

Реакцията на аглутинация (РА) е слепване и утаяване на микроби или други клетки под въздействието на антитела в присъствието на електролит (изотоничен разтвор на натриев хлорид). Получената утайка се нарича аглутинирам.

За реакцията ви трябва:

1. Антитела (аглутинини) - намират се в серума на пациента или в имунния серум.

2. Антиген - суспензия от живи или убити микроорганизми, червени кръвни клетки или други клетки.

3. Изотоничен разтвор.

Тестът за аглутинация за серодиагностика се използва широко в Коремен тиф, паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакция на Райт) и др. Антитялото в този случай е серума на пациента, а антигенът е известен микроб.

При идентифициране на микроби или други клетки тяхната суспензия се използва като антиген, а известен имунен серум се използва като антитяло. Тази реакция се използва широко в диагностиката чревни инфекции, магарешка кашлица и др.

В лабораторната практика се използват две реакции на хемаглутинация (HRA), които се различават по своя механизъм на действие.

Първо RGAсе отнася до серологични. При тази реакция червените кръвни клетки се аглутинират при взаимодействие с подходящи антитела (хемаглутинини). Реакцията се използва широко за определяне на кръвни групи.

Второ RGAне е серологично. При него слепването на червените кръвни клетки се причинява не от антитела, а от специални вещества, образувани от вируси. Например грипният вирус аглутинира червените кръвни клетки на кокошките и морските свинчета, а полиомиелитният вирус аглутинира червените кръвни клетки на овцете. Тази реакция позволява да се прецени наличието на определен вирус в изследвания материал.

Това е серологична реакция, при която специфични антивирусни антитела, взаимодействащи с вируса (антиген), го неутрализират и го лишават от способността да аглутинира червените кръвни клетки, т.е. инхибират реакцията на хемаглутинация. Високата специфичност на реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (HAI) позволява да се използва за определяне на вида и дори вида на вирусите, открити по време на HRA теста.

Реакцията на непряка (пасивна) хемаглутинация (IRHA) се основава на факта, че червените кръвни клетки, ако разтворим антиген е адсорбиран на тяхната повърхност, придобиват способността да аглутинират при взаимодействие с антитела към адсорбирания антиген. Диаграмата на RNGA е показана на фиг. RNGA се използва широко в диагностиката на редица инфекции.

Ориз.Схема на реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA). А - получаване на еритроцитен диагностикум; B - RNGA: 1-еритроцит: 2 - изследван антиген; 3 - еритроцитен диагностикум; 4 - антитяло към изследвания антиген: 5 - аглутинат.

Използвайки RNGA, можете да определите неизвестен антиген, ако известните антитела са адсорбирани върху еритроцитите.

Реакция на хемаглутинация (HRA)

RGA се основава на факта, че някои видове бактерии и вируси имат способността да се адсорбират върху повърхността на червените кръвни клетки различни видовеживотни (и птици), което ги кара да се слепват и да образуват аглутинат (директен RGA).

Адсорбцията на антиген (бактерии, вируси) върху повърхността на еритроцитите не винаги се проявява чрез образуване на видима утайка; В допълнение, RHA е неспецифичен, тъй като червените кръвни клетки от един и същи животински вид могат да адсорбират различни антигени.

Специфична е реакцията на пасивна (индиректна) хемаглутинация (RPHA). За извършване на тази процедура първо се приготвя еритроцитна диагностика (еритроцити, върху които е адсорбиран антигенът). За тази цел кръвта от овце (или петел) се получава стерилно, дефибринира се и се промива няколко пъти във фосфатно буфериран разтвор (рН 7,2) чрез 3-5-кратно центрофугиране. Супернатантата се отстранява, концентрацията на еритроцитите се регулира до 2,5% (1:40). Към 2,5% суспензия от еритроцити добавете равен обем (1 ml или 0,5 ml) суспензия от бактерии от изследваните видове микроби в концентрация 5-10 милиарда клетки на 1 ml. Червените кръвни клетки лесно адсорбират полизахаридните антигени. За да се адсорбира протеинов антиген, еритроцитите се третират предварително с танин в разреждане 1: 20 000. Еритроцитите в комбинация с добавения антиген се оставят за сенсибилизация (адсорбция) в продължение на 2 часа в термостат (37 ° C), след което се центрофугират. отново при 3-4 хиляди оборота в минута за 5 минути с фосфатен буферен разтвор (фиг. 9.13).

Полученият еритроцитен диагностикум се поставя в епруветки (или ямки в плексигласова плоскост) и към него се добавя стандартен имунен серум.

В положителни случаи ще настъпи RHA - загуба на червени кръвни клетки под формата на характерна люспеста или гранулирана утайка, разпределена по цялата повърхност на дъното на епруветката (хемаглутинат). Това означава, че видът на изследвания микроб (антиген) е специфичен за антителата на имунния серум. В отрицателни случаи незалепените червени кръвни клетки ще се утаят на дъното под формата на малък равен кръг.

За по-голяма надеждност на резултатите се извършва RPGA забавяне на реакцията(спиране) феномен на хемаглутинация(RZGA) или неговата модификация - реакция на неутрализация на антитела(АПИ).

Ориз. 9.13. Реакция на пасивна хемаглутинация (схема): Er - червени кръвни клетки: AG - антиген: AT - антитяло

Същността на РЗГАсе състои в това, че се извършва реакция на аглутинация със специфичен диагностичен серум и тестов антиген (видът на изследвания микроб се използва като антиген). Тази смес се държи 1-2 часа при 37 °C, след което се добавят червени кръвни клетки. Ако тестовият антиген е хомоложен на антителата на диагностичния серум, те взаимодействат помежду си и добавените червени кръвни клетки не аглутинират - резултатът от реакцията е положителен. Ако изследваният антиген не е хомоложен на серумните антитела или не се съдържа в материала, тогава добавените еритроцити адсорбират антигена и се получава RGA - резултатът от RGA е отрицателен, видът на изследвания микроб (антиген) не се установява.

Методика за определяне на PH Aсе състои в вземане на равни обеми и смесване на диагностичен имунен серум с различни разрежданияизследваният материал (желаният антиген), оставен за контакт за 1-2 часа, след което се добавят червени кръвни клетки, сенсибилизирани с определен (известен) антиген, специфичен за серумни антитела (еритроцитна диагностика). Когато желаният антиген реагира със серумните антитела, те се неутрализират и добавените червени кръвни клетки не аглутинират, RHA не възниква - резултатът от RHA е положителен. Ако тестовият материал не съдържа антиген, специфичен за антителата на използвания серум, няма да настъпи неутрализация на антителата. Следователно при добавяне на еритроцитна диагностика се появява аглутинация на еритроцитите (хемаглутинация) и резултатът от РНК е отрицателен. Реакцията на неутрализация на антитела е високочувствителен метод за откриване на антиген не само в суспензия от живи (или убити) бактерии, но и в суспензия от смлени тъкани на различни органи, нативни и нагрети секрети и екскрети на болен организъм.