Мишена: Овладейте техниката за извършване на реакции на аглутинация и реакции на утаяване за диагностика на инфекциозни заболявания.
Модул 1.Морфология и физиология на микроорганизмите. Инфекция. Имунитет.
Тема 16:Реакция на аглутинация. Реакция на утаяване.
Уместност на темата.Под имунитетпредполагат имунитет на организма към инфекциозни и неинфекциозни агенти ( патогенни микроорганизми, чужди протеини и други вещества). Тези агенти се наричат антигени. Имунитетът може да бъде вроден или придобит. Вродена– когато се образуват тъканни и хуморални защитни устройства, предизвикващи имунитет към инфекциозни заболявания, предавани по наследство.
Придобити– осъществява се от имунната система на организма под формата на производство на антитела или натрупване на сенсибилизирани лимфоцити. Разделя се на естествени и изкуствени. Според механизма на действие се разделя на активни и пасивни. Във всички имунологични реакции основният компонент е антигенът.
Главна функция имунна система, който се състои от лимфоидна тъкан, е да разпознава чужди агенти (антигени) и да ги неутрализира.
Антигените могат да проникнат в тялото чрез Въздушни пътища, храносмилателен тракт, през кожата и лигавиците. Всеки антиген стимулира образуването на специални протеинови вещества - антитела.
Антигенисе делят на пълни и долни (хаптени). Пълни антигенипредизвикват пълен имунен отговор. Дефектни антигениТе не предизвикват имунен отговор сами по себе си, но понякога придобиват тази способност, когато се конюгират с протеинови носители с високо молекулно тегло. Освен това има антигени: хемихаптени, проантигени, хетероантигени и изоантигени.
Антителаса имуноглобулини от човешки или животински кръвен серум. Антителата се образуват след инфекция и в резултат на имунизация с отслабени или убити бактерии, рикетсии, вируси, токсини и други агенти. Антитела– имуноглобулинови протеини химичен съставпринадлежат към гликопротеините. Въз основа на тяхната структура и имунобиологични свойства имуноглобулините се разделят на 5 класа: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.
Нормални антителаоткрити при хора и животни, които не са имунизирани. Специфични антителасе образуват в резултат на инфекция или имунизация.
Реакцията между антитяло и антиген се нарича серологични. Серологичните тестове са високо специфични и се използват при диагностицирането на много инфекциозни заболявания. Прави се разлика между реакции на аглутинация и реакции на утаяване.
1. Реакция на аглутинация (RA) се основава на взаимодействието на антиген (аглутиноген) и антитяло (аглутинин), при което микробните тела се слепват и се утаяват в присъствието на електролит. Съществуват различни модификации на реакцията на аглутинация.
Най-висока стойностимам:
- Макроскопска (разширена) аглутинация в епруветки.Към серума на пациента се добавя суспензия от микроби (diagnosticum) и след 1 час в термостат при температура 37 градуса се отбелязва разреждането (титъра) на серума, при което е настъпила реакцията. Реакцията на аглутинация се счита за положителна, когато на дъното на епруветката се образува утайка с ясно изразено избистряне на супернатантната течност. Тази утайка се нарича аглутинат.
Въз основа на естеството на аглутината се разграничават финозърнеста (О) и едрозърнеста (Н) аглутинация. За идентифициране на финозърнест аглутинат се използва аглутиноскоп. Записването на резултатите започва с контролни епруветки. Последното разреждане на серума, при което се наблюдава аглутинация, се счита за неговия титър.
Цел на реакцията: откриване на антитела в серума на пациента.
- Микроскопски (ускорен ) приблизителна аглутинация върху стъкло.Капка бактериална култура се добавя към капка диагностичен имунен серум и се смесва равномерно. Реакцията протича при стайна температура за 5-10 минути. След това се прави счетоводство. Ако реакцията е положителна, в серумната капка се отбелязва натрупване на бактерии под формата на зърна или люспи. Цел на реакцията: определяне на вида на патогена с помощта на известен диагностичен серум.
- Индиректна (пасивна) реакция на хемаглутинация (IRHA).Същността на тази реакция е, че червените кръвни клетки на овцете са способни да адсорбират антигени на повърхността си. Под въздействието на специфични антитела, червените кръвни клетки се слепват и се утаяват, образувайки хемаглутинат на дъното. Реакцията е силно чувствителна и специфична. RNGA ви позволява да откриете минимално количество антитела и дефектни антигени от полизахаридна природа. Тази реакция се използва при диагностицирането на много инфекциозни заболявания (коремен тиф и тиф, паратиф, туберкулоза и др.).
2. Реакция на утаяване (RP ) – утаяване на комплекса антиген-антитяло. Основната разлика между RP и RA е, че при RA се използва корпускуларен антиген, докато при RP антигенът е колоидно вещество с протеинова или полизахаридна природа. При тази реакция антигенът се нарича преципитоген, а антителата се наричат преципитини. Реакцията се провежда в епруветки чрез наслояване на антигенния разтвор върху имунния серум. С оптимално съотношение на антиген и антитела на границата
Тези разтвори образуват пръстен от утайка. Ако като антиген се използват сварени и филтрирани екстракти от органи и тъкани, реакцията се нарича реакция на термопреципитация (реакция на Асколи, която се използва в диагнозата антракс, чума, туларемия и др.).
Реакциите на утаяване в агар са широко разпространени: метод на проста дифузия, метод на двойна дифузия.
Вид валежи е реакция на флокулация– за определяне на активността на токсоид или антитоксичен серум. В допълнение, тази реакция може да се използва за определяне на токсигенността на щамовете Corynebacterium diphtheriae.
Конкретни цели:
· Обяснява ролята на антигените като индуктори на имунен отговор;
· Описва структурата на антигените, включително антигените на микроорганизмите;
· Опишете механизма на реакцията на аглутинация;
· Опишете механизма на реакцията на утаяване.
Умейте да:
· Обяснява ролята на антигените като индуктори на имунен отговор;
· Опишете структурата на антителата (различни класове имуноглобулини);
· Анализира механизма на взаимодействие на антитела с антигени;
· Интерпретира резултатите от реакцията на аглутинация;
· Интерпретиране на резултатите от реакцията на утаяване;
· Анализирайте получените резултати.
1. Дефиниция на понятието "антигени", "антитела".
2. Ролята на антигените като индуктори на имунния отговор.
3. Структура на антителата (различни класове имуноглобулини).
4. Механизмът на взаимодействие на антитела с антигени.
5. Имунни реакции, ролята им в имунния отговор и диагностика на инфекциозни заболявания.
6. Механизъм на реакцията на аглутинация.
7. Механизъм на реакцията на утаяване.
Практически задачи, изпълнявани в клас:
1. Извършване на реакция на аглутинация за откриване на антитела в серума на пациента.
2. Създаване на реакция на микроаглутинация върху стъкло с диагностични серуми за идентифициране на чиста култура от бактерии.
3. Оценка на резултатите от реакцията на аглутинация.
4. Създаване на реакция на утаяване за откриване на бактериален антиген.
5. Оценка на резултатите от реакцията на утаяване.
6. Оценка на резултатите от реакцията на индиректна хемаглутинация.
7. Съставяне на протокола.
Литература:
1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусология и имунология , – Киев: Висше училище, 1992.- 431 с.
2. Воробьов А.В., Биков А.С., Пашков Е.П., Рибакова А.М. Микробиология.- М.: Медицина, 1998.- 336 с.
3. Медицинска микробиология /Под редакцията на V.P. Покровски – М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001. – 768 с.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинска микробиология, имунология и вирусология / Учебник за медицински университети, Санкт Петербург: “Специална литература”, 1998.- 592 с.
5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология / Учебник - 2-ро изд., прер. и допълнителен – М.: Медицина, 1983.- 512 с.
6. Записки от лекции.
1. Титов М.В. Инфекциозни заболявания.- К., 1995.– 321 с.
2. Шувалова Е.П. Инфекциозни болести , – М.: Медицина, 1990.- 559 с.
Реакцията на аглутинация се основава на специфичното взаимодействие на антитела (аглутинини) с цели микробни или други клетки. В резултат на това взаимодействие се образуват агломератни частици, които се утаяват (аглутинират). Бактерии, протозои, гъбички, дрожди, рикетсии, еритроцити и други клетки, както живи, така и убити, могат да участват в реакцията на аглутинация. Реакцията протича в две фази: първата е специфична комбинация от антиген и антитяло, втората е неспецифична, т.е. образуването на видим аглутинат. Утаяването на аглутината става в присъствието на електролити, като натриев хлорид. Микроорганизмите в аглутината остават живи, но губят своята подвижност.
Реакцията на аглутинация се използва широко за серологична диагностика на инфекциозни заболявания и определяне на антигенната структура на изолирани микроби. За определяне на антигенната структура на патоген, изолиран от тялото на пациент или носител, се използва специфичен имунен серум, получен чрез имунизиране на животни (заек, магаре, овца) с определени микроорганизми. Идентифицирането на микроба се извършва в реакция на аглутинация върху стъкло с адсорбирани или монорецепторни серуми или в епруветки със специфични аглутиниращи серуми. Адсорбираните серуми съдържат антитела само към антигени, специфични за даден микроб, а монорецепторните серуми съдържат антитела само към един специфичен антиген на патогена.
Видовите серуми съдържат антитела към всички антигени на определен микроб.
Дали изолираната култура от микроорганизми принадлежи на този видопределен чрез аглутинация с известен серум до титъра на антитялото, посочен върху етикета на серумната ампула. Титърът на антителата на серума се счита за последното му разреждане, при което все още се наблюдава аглутинация на културата от микроби, използвани за имунизиране на животното. Адсорбираните и монорецепторните серуми обикновено се използват неразредени в реакцията на аглутинация със стъкло.
Когато се определя наличието на антитела в кръвния серум на пациента, той се разрежда с изотоничен разтвор на натриев хлорид, като се започне от разреждане от 1: 50 до 1: 800 или повече. Към всяко разреждане се добавя суспензия от живи или убити микроби. Препаратите, съдържащи микроби, убити от топлина или формалдехид, се наричат диагностикуми. Диагностикумите, получени чрез нагряване на култури от микроорганизми, съдържат само соматични антигени. Когато се използва само формалдехид, микробите запазват флагеларните си антигени.
При наличие на антитела в кръвта на пациента диагностичният тест, взет в реакцията, се слепва и се образува утайка (аглутинат) върху две епруветки. В този случай резултатите от реакцията на аглутинация се считат за положителни. В контролната епруветка, в която се добавят изотоничен разтвор на натриев хлорид и диагностикум, суспензията от микроби трябва да бъде хомогенна ( отрицателна реакцияаглутинация).
Резултатите от реакцията на аглутинация при някои заболявания, като лептоспироза, се вземат предвид само микроскопски в тъмно зрително поле на микроскоп (микроаглутинация). За да се направи серологична диагноза на заболяване, се взема предвид диагностичното заболяване. Обикновено съответства на серумно разреждане 1:100 или 1:200.
Антителата в кръвния серум на пациента могат да бъдат открити с помощта на реакцията на аглутинация при коремен тиф и паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакция на Райт), туларемия и др.
Реакцията на Кастелани. За някои инфекциозни заболяванияили имунизация с микроорганизми, съдържащи групови антигени, в кръвния серум, освен антитела, специфични за този тип, се появяват и групови антитела. В този случай свързани бактериални видове ще бъдат аглутинирани от получените серуми.
Кастелани предложи метод за адсорбция на групови антитела от имунни серуми, основан на тяхното отстраняване с помощта на микроорганизми от сродни видове, които имат групови антигени, но нямат специфични. Култура от такива микроорганизми, добавена към серума, адсорбира антитела от неспецифична група и след отстраняване на комплекса антиген-антитяло чрез центрофугиране, в серума остават само специфични имуноглобулини. Серумите, обработени по метода на Кастелани, могат да се използват в реакцията на аглутинация като високо специфични.
Имунодиагностични реакции. Реакции антиген-антитяло и реакции с белязани компоненти. Използва се за идентифициране на микроорганизми и диагностика на инфекциозни заболявания.
Имунните реакции се използват при диагностични и имунологични изследвания при пациенти и здрави хора. За тази цел те използват серологични методи (от лат. серум - суроватка и лога - обучение), т.е. методи за изследване на антитела и антигени с помощта на реакции антиген-антитяло, определени в кръвен серум и други течности, както и телесни тъкани.
Откриването на антитела срещу патогенни антигени в кръвния серум на пациента позволява да се постави диагноза на заболяването. Серологичните изследвания се използват и за идентифициране на микробни антигени, различни биологично активни вещества, кръвни групи, тъканни и туморни антигени, имунни комплекси, клетъчни рецептори и др.
Когато се изолира микроб от пациент, патогенът се идентифицира чрез изследването му антигенни свойстваизползване на имунни диагностични серуми, т.е. кръвни серуми на хиперимунизирани животни, съдържащи специфични антитела. Това е т.нар серологична идентификациямикроорганизми.
В микробиологията и имунологията широко се използват реакции на аглутинация, преципитация, неутрализация, реакции с участието на комплемент, с използване на белязани антитела и антигени (радиоимунологични, ензимни имуноанализа, имунофлуоресцентни методи). Изброените реакции се различават по регистриран ефект и техника на производство, но всички те са основни. се основават на реакцията на взаимодействие на антиген с антитяло и се използват за откриване както на антитела, така и на антигени. Имунните реакции се характеризират с висока чувствителност и специфичност.
По-долу са дадени принципите и диаграмите на основните имунодиагностични реакции. Дадена е подробна техника за настройка на реакциите. практически насоки за имунодиагностика.
Реакция на аглутинация - РА(от лат. аглути- нация- адхезия) е проста реакция, при която антителата се свързват с корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: екстензивна, индикативна, индиректна и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка
RA се използва за:
определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакция на Райт, Хеделсън), коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;
определяне на патогена, изолиран от пациента;
определяне на кръвни групи с помощта на моноклонални антитела срещу еритроцитни алоантигени.
За определяне на антитела при пациент слагамподробна реакция на аглутинация:добавете към разрежданията на кръвния серум на пациента диагностикум(суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 °C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което настъпва аглутинация, т.е. образува се утайка.
Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това са особеностите на взаимодействие на диагностикуми (О- и R-антигени) със специфични антитела. Реакция на аглутинация с О-диагностикум(бактерии, убити от топлина, запазващи устойчивост на топлина О-антиген)протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалдехид, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е груба и протича по-бързо.
Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете показателна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Провежда се индикативна реакция върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента, в разреждане 1:10 или 1:20. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка, съдържаща серум и микроби, a обширна реакция на аглутинацияв епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към които се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на прозрачност на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се наблюдава аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
Различни родствени бактерии могат да бъдат аглутинирани от един и същ диагностичен аглутиниращ серум, което затруднява идентифицирането им. Затова използват адсорбирани аглутиниращи серуми,от които кръстосано реагиращите антитела са били отстранени чрез адсорбция към сродни бактерии. Такива серуми задържат антитела, които са специфични само за дадена бактерия. Производството на специални монорецепторни диагностични аглутиниращи серуми е предложено от A. Castellani (1902).
Индиректна (пасивна) реакция на хемаглутинация (RNGA, RPGA) се основава на използването на еритроцити с адсорбирани на повърхността им антигени или антитела, взаимодействието на които със съответните антитела или антигени на кръвния серум кара еритроцитите да се слепват и да падат на дъното на теста. тръба или клетка Vпод формата на назъбена утайка (фиг. 13.2). В случай на отрицателна реакция, червените кръвни клетки се установяват ■ под формата на „копче“. Обикновено антителата се откриват в RNGA с помощта на антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити с адсорбирана Наги с антигени. Понякога се използва антитяло еритроцитна диагностика, върху която се адсорбират антитела. Например, ботулинов токсин може да бъде открит чрез добавяне на еритроцитно антитяло ботулинов токсин към него (тази реакция се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация- RONG). RNGA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания, определяне гонадотропен хормон Vурина при установяване на бременност, за откриване свръхчувствителностДа се лекарства, хормони и в някои други случаи.
Реакция на коаглутинация . Патогенните клетки се определят с помощта на стафилококи, предварително третирани с имунен диагностичен серум. Стафилококи, съдържащи протеин а,имащи афинитет къмФК - фрагмент от имуноглобулини, неспецифично адсорбира антимикробни антитела, които след това взаимодействат с активни центрове със съответните микроби, изолирани от пациенти. В резултат на коаглутинацията се образуват люспи, състоящи се от стафилококи, диагностични серумни антитела и открития микроб.
Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на вирусни антигени от имунни серумни антитела, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки (фиг. 13.3). RTGA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (вируси на грип, морбили, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи и др.) Могат да аглутинират червените кръвни клетки на различни животни.
Реакция на аглутинация за определяне на кръвни групи използвани за установяване на системата ABO (вижте раздел 10.1.4.1), използвайки аглутинация на червени кръвни клетки с имунни серумни антитела срещу антигени на кръвна група A (II), B (III). Контролът е: серум, който не съдържа антитела, т.е AB (GU)кръвни групи; антигени, съдържащи се в червените кръвни клетки от групи A (II), B (III). Отрицателната контрола не съдържа антигени, т.е. използвани са еритроцити от група 0 (I).
IN реакции на аглутинация за определяне на Rh фактора(вижте раздел 10.1.4.1) използвайте анти-резус серуми (поне две различни серии). Ако върху мембраната на изследваните еритроцити има Rh антиген, настъпва аглутинация на тези клетки. За контрол служат стандартните Rh-положителни и Rh-отрицателни еритроцити от всички кръвни групи.
Реакция на аглутинация за определяне на анти-резус антитела ( индиректна реакцияКумбс)използвани при пациенти с интраваскуларна хемолиза. При някои от тези пациенти се откриват антирезус антитела, които са непълни и моновалентни. Те специфично взаимодействат с Rh-положителните еритроцити, но не предизвикват тяхната аглутинация. Наличието на такива непълни антитела се определя чрез индиректния тест на Coombs. За да направите това, към системата от анти-Rh антитела + Rh-положителни еритроцити се добавя антиглобулинов серум (антитела срещу човешки имуноглобулини), което предизвиква аглутинация на еритроцитите (фиг. 13.4). С помощта на реакцията на Кумбс се диагностицират патологични състояния, свързани с интраваскуларен лизис на еритроцити от имунен произход, например хемолитична болест на новороденото: еритроцитите на Rh-положителен плод се комбинират с непълни антитела срещу Rh фактора, циркулиращ в кръвта, които имат преминава през плацентата от Rh-отрицателна майка.
Реакции на утаяване
Реакция на утаяване - RP (отлат. praecipito- преципитат) - това е образуването и утаяването на комплекс от разтворим молекулярен антиген с антитела под формата на мътност, т.нар. утайка.Образува се чрез смесване на антигени и антитела в еквивалентни количества; излишъкът на един от тях намалява нивото на образуване на имунен комплекс.
Реакциите на утаяване се извършват в епруветки (реакция на пръстеновидно утаяване),в гелове, хранителни среди и др. Широко разпространени са разновидностите на реакции на утаяване в полутечни гелове от агар или агароза: двойна имунодифузия по Ouchterlony. радиална имунодифузия, имуноелектрофорезаи т.н.
Реакция на пръстеновидно утаяване . Реакцията се провежда в тесни епруветки за утаяване с имунен серум, върху който е наслоен разтворим антиген. При оптимално съотношение на антиген и антитела, на границата на тези два разтвора се образува непрозрачен пръстен от утайка (фиг. 13.5). Излишъкът от антиген не влияе върху резултата от реакцията на утаяване на пръстена поради постепенната дифузия на реагентите към границата на течността. Ако варени и филтрирани водни екстракти от органи или тъкани се използват като антигени в реакцията на утаяване на пръстена, тогава тази реакция се нарича реакция на термоутаяване (реакция на Асколи,с антракс/
Реакция на двойна имунодифузия по Ouchteruny . За да настроите реакцията, разтопете агар гелтънък слой се излива върху стъклена плоча и след като се втвърди, в него се изрязват отвори с размер 2-3 мм. Антигените и имунните серуми се поставят отделно в тези ямки, които дифундират една към друга. На мястото на срещата, в еквивалентни пропорции, те образуват утайка под формата на бяла ивица. В многокомпонентни системи се появяват няколко линии от утайка между ямките с различни антигени и серумни антитела; за идентични антигени линиите на утайката се сливат; за нееднакви се пресичат (фиг. 13.6).
Реакция на радиална имунодифузия . Имунен серум с разтопен агар гел се излива равномерно върху стъклото. След втвърдяване в гела се правят ямки, в които се поставя антигенът различни разреждания. Антигенът, дифундиращ в гела, образува пръстеновидни зони на утаяване около ямките с антитела (фиг. 13.7). Диаметърът на преципитационния пръстен е пропорционален на концентрацията на антигена. Реакцията се използва за определяне на съдържанието в кръвта на имуноглобулини от различни класове, компоненти на системата на комплемента и др.
Имуноелектрофореза- комбинация от електрофореза и имунопреципитация: смес от антигени се въвежда в ямките на гела и се разделя в гела с помощта на електрофореза. След това в жлеба, успоредно на зоните на електрофореза, се въвежда имунен серум, чиито антитела, дифундирайки в гела, образуват линии на утаяване в точката на среща с антигена.
Реакция на флокулация(според Рамон) (от лат. флокус -вълнени люспи) - появата на опалесценция или флокулентна маса (имунопреципитация) в епруветка по време на реакция токсин-антитоксин или токсоид-антитоксин. Използва се за определяне на активността на антитоксичен серум или токсоид.
Имунен електронна микроскопия - електронна микроскопия на микроби, често вируси, третирани с подходящи антитела. Вирусите, третирани с имунен серум, образуват имунни агрегати (микропреципитати). Около вирионите се образува "венче" от антитела, контрастиращи с фосфорволфрамова киселина или други електронно-оптически плътни препарати.
Реакции, включващи комплемент
Реакции, включващи комплементсе основават на активирането на комплемента от комплекса антиген-антитяло (реакция на фиксиране на комплемента, радиална хемолиза и др.).
Реакция на фиксиране на комплемента (RSK) е, че когато антигените и антителата съответстват едно на друго, те образуват имунен комплекс, към който чрезФК - фрагмент на антитяло е прикрепен към комплемента (С), т.е. комплементът е свързан от комплекса антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен (фиг. 13.8). RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, когато се образува комплексът антиген-антитяло, комплементът се свързва, а след това във 2-рата фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцитите, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не съвпадат (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит - антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.
RSC се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по-специално сифилис (реакция на Васерман).
Реакция на радиална хемолиза (RRH) ) поставени в ямките на агар гел, съдържащ овчи червени кръвни клетки и комплемент. След въвеждане на хемолитичен серум (антитела срещу овчи червени кръвни клетки) в ямките на гела, около тях се образува зона на хемолиза (в резултат на радиална дифузия на антитела). По този начин е възможно да се определи активността на комплемента и хемолитичния серум, както и антителата в кръвния серум на пациенти с грип, рубеола, енцефалит, пренасян от кърлежи. За да направите това, съответните антигени на вируса се адсорбират върху еритроцитите и кръвният серум на пациента се добавя към ямките на гела, съдържащ тези еритроцити. Антивирусните антитела взаимодействат с вирусни антигени, адсорбирани върху еритроцитите, след което
След това компонентите на комплемента се присъединяват към този комплекс, причинявайки хемолиза.
Реакция на имунна адхезия (IAR) ) се основава на активиране на системата на комплемента от корпускулярни антигени (бактерии, вируси), третирани с имунен серум. В резултат на това се образува активиран трети компонент на комплемента (C3b), който се прикрепя към корпускуларния антиген като част от имунния комплекс. Еритроцитите, тромбоцитите и макрофагите имат рецептори за C3b, поради което, когато тези клетки се смесят с имунни комплекси, носещи C3b, се получава тяхното комбиниране и аглутинация.
Реакция на неутрализация
Антителата на имунния серум са способни да неутрализират увреждащото действие на микробите или техните токсини върху чувствителни клетки и тъкани, което е свързано с блокадата на микробните антигени от антитела, т.е. неутрализиране. Реакция на неутрализация(RN) се извършва чрез въвеждане на смес антиген-антитяло в животни или в чувствителни тестови обекти (клетъчна култура, ембриони). При липса на увреждащи ефекти на микроорганизми или техните антигени или токсини при животни и тестови обекти, те говорят за неутрализиращия ефект на имунния серум и следователно за специфичността на взаимодействието на комплекса антиген-антитяло (фиг. 13.9).
Имунофлуоресцентна реакция - RIF (метод на Coons)
Има три основни вида метод: директен, косвен (фиг. 13.10), с допълнение. Реакцията на Кунс е бърз диагностичен метод за идентифициране на микробни антигени или определяне на антитела.
Директен RIF метод се основава на факта, че тъканни антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп.
Бактериите в намазка, обработена с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.
Индиректен RIF метод се състои от идентифициране на комплекса антиген-антитяло с помощта на антиглобулин (анти-антитела) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробните антигени, се измиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на намазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, белязан с флуорохроми. В резултат на това се образува комплекс от микроб + антимикробни заешки антитела + антизаешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцентен микроскоп, както при директния метод.
Ензимен имуносорбентен метод или анализ (ELISA)
ELISA -откриване на антигени, като се използват съответните им антитела, конюгирани с ензим-маркер (пероксидаза от хрян, бета-галактозидаза или алкална фосфатаза). След комбиниране на антигена с белязания с ензим имунен серум, субстратът/хромогенът се добавя към сместа. Субстратът се разцепва от ензима и цветът на реакционния продукт се променя - интензитетът на цвета е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.
Твърда фаза ELISA - най-често срещаният вариант на имунологичен тест, когато един от компонентите на имунната реакция (антиген или антитела) се сорбира върху твърд носител, например в ямките на полистиролови плаки
При определяне на антитела кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, маркиран с ензим, и субстратът (хромоген) за ензима се добавят последователно към ямките на плаките със сорбиран антиген.
Всеки път след добавяне на друг компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. При положителен резултатЦветът на хромогенния разтвор се променя. Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитела. След това желаният антиген се добавя към ямките със сорбирани антитела, добавя се имунен серум срещу антигена, маркиран с ензим, и след това се добавя субстрат за ензима.
Конкурентна ELISA опция . целевият антиген и белязаният с ензим антиген се конкурират помежду си, за да свържат ограничено количество имунни серумни антитела. Друг тест - антителата, които търсите
и белязаните антитела се конкурират помежду си за антигени.
Радиоимунологичен метод или анализ (RIA)
Високочувствителен метод, базиран на реакцията антиген-антитяло, използваща антигени или антитела, маркирани с радионуклид (125 J, 14 C, 3 H, 51 Cr и др.). След тяхното взаимодействие, полученият радиоактивен имунен комплекс се отделя и неговата радиоактивност се определя в съответния брояч (бета или гама лъчение):
интензитетът на радиацията е право пропорционален на броя на свързаните молекули антиген и антитяло.
При твърдофазна RIA версия един от реакционните компоненти (антиген или антитела) се сорбира върху твърда подложка, например в ямките на полистиролови микропанели. Друг вариант на метода е конкурентен RIA.желаният антиген и белязаният с радионуклид антиген се конкурират помежду си, за да свържат ограничено количество имунни серумни антитела. Тази опция се използва за определяне на количеството антиген в тестовия материал.
RIA се използва за идентифициране на микробни антигени, определяне на хормони, ензими, лекарствени веществаи имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в изследвания материал в незначителни концентрации - 10~ |0 -I0~ 12 g/l. Методът представлява определена опасност за околната среда.
Имуноблотинг
Имуноблотинг (IB)- високочувствителен метод, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA.
Антигенът се изолира с помощта на електрофореза в полиакриламиден гел, след което се прехвърля (блотинг - от английски. петно, петна) от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и проявени с помощта на ELISA. Компаниите произвеждат такива ленти с „петна“
антигени. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. След това, след инкубация, пациентът се промива от несвързани антитела и се прилага серум срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензим. Комплексът антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig, образуван върху лентата, се открива чрез добавяне на субстрат/хромоген, който променя цвета си под действието на ензим (фиг. 13.12).
IB се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.
Аглутинацията е слепване на бактерии в резултат на взаимодействието на специфични АТ с тях. За провеждане на РА са необходими три компонента: 1) АГ (аглутиноген); 2) АТ (аглутинин); 3) електролитен разтвор (изотоничен разтвор на натриев хлорид). В реакцията на аглутинация участват само корпускулярни антигени (бактерии, червени кръвни клетки, натоварени с антиген латексови частици).
Реакция на аглутинация върху стъкло. Капка диагностичен серум се нанася върху обезмаслено предметно стъкло с пипета (серумно разреждане 1:10 - 1:20). С помощта на бактериологична примка се взема чиста култура на изследвания микроорганизъм от повърхността на наклонения агар, прехвърля се в капка серум и се смесва. Резултатът от реакцията се отчита с просто око след 3-5 минути. Ако реакцията е положителна, се забелязва появата на люспи (големи или малки) в капка серум, ясно видими на тъмен фон, когато предметното стъкло се разклати. При отрицателна реакция течността остава равномерно мътна.
Реакция на аглутинация в епруветки. В редица епруветки се добавя 1 ml физиологичен разтвор. Към първата епруветка се добавя равен обем от тествания кръвен серум. Приготвят се серийни двукратни разреждания на серум (серумно титруване), след което във всяка епруветка се добавят 2 капки суспензия от инактивирани бактерии (diagnosticum). Епруветките се поставят в термостат при 37 °C за 2 часа. Реакцията протича с образуването на малки люспи, невидими с невъоръжено око, поради което резултатите се записват при леко увеличение в специален уред - аглутиноскоп. Интензивността на аглутинацията се взема предвид по системата "четири плюс": пълна аглутинация - 4+, частична аглутинация - 3+ или 2+, съмнителен резултат - +. Последното разреждане, при което се наблюдава аглутинация 2+, се приема като титър на антитела в тестовия серум.
Провежда се реакция на аглутинация в епруветки (обширна реакция на аглутинация), за да се определи титърът на антителата срещу патогени Коремен тифи паратиф (реакция на Видал), бруцелоза (реакция на Райт), тиф (реакция на Вайгл).
Аглутинацията (от латински agglutinatio - слепване) е слепване (свързване) на антиген-носещи корпускулярни частици (цели клетки, латексни частици и др.) с молекули на специфични антитела в присъствието на електролити, което завършва с образуването на люспи или утайка (аглутинират) видими с просто око. Естеството на утайката зависи от естеството на антигена: камшичестите бактерии произвеждат груба флокулентна утайка, камшичестите и некапсулните бактерии произвеждат финозърнеста утайка, а капсулните бактерии произвеждат нишковидна утайка. Прави се разлика между директна аглутинация, при която собствените антигени на бактериална или друга клетка, като еритроцити, участват директно във взаимодействието със специфични антитела; и косвени или пасивни, при които бактериални клетки или еритроцити, или частици от латекс са носители не на собствените си, а на чужди антигени (или антитела), сорбирани върху тях, за да идентифицират антитела (или антигени), специфични за тях. Реакцията на аглутинация включва главно антитела, принадлежащи към класовете IgG и IgM. Протича в две фази: първо, възниква специфично взаимодействие между активния център на антителата и антигенната детерминанта; този етап може да възникне при липса на електролити и не е придружен от видими промени в реагиращата система. За втория етап - образуването на аглутинат - е необходимо наличието на електролити, които намаляват електрически зарядкомплекси антиген + антитяло и ускоряват процеса на тяхното слепване. Тази фаза завършва с образуването на аглутинат.
Реакциите на аглутинация се извършват върху стъклени или гладки картонени плочи или в стерилни епруветки за аглутинация. Обикновено се използват реакции на аглутинация (директни и пасивни) върху стъкло ускорен методоткриване на специфични антитела в серума на пациента (например при бруцелоза) или за серологична идентификация на патогена. В последния случай обикновено се използват добре пречистени (адсорбирани) диагностични серуми, съдържащи само монорецепторни антитела или набор от тях към различни антигени. Безспорното предимство на реакцията на аглутинация върху стъкло е простотата на нейното изпълнение и факта, че отнема няколко минути или дори секунди, тъй като и двата компонента се използват в концентрирана форма. Той обаче има само качествена стойност и е по-малко чувствителен от епруветка. Обширната реакция на аглутинация в епруветките дава по-точни резултати, тъй като ви позволява да определите количественото съдържание на антитела в серума (установите неговия титър) и, ако е необходимо, да регистрирате факта на повишаване на титъра на антителата, което има диагностична стойност . За да се постави реакцията, разреден 0,85% разтвор се добавя към аглутинационните епруветки по определен начин. разтвор на NaClсерум и равен обем (обикновено 0,5 ml) суспензия от стандартен диагностикум (или тест култура), съдържаща 1 милиард бактерии в 1 ml. Резултатите от реакцията на аглутинация се записват първо след 2 часа инкубация на епруветките при 37 °C и накрая след 20-24 часа според два критерия: наличието и размера на утайката и степента на прозрачност на супернатантната течност. Оценяването се извършва по четирикратната система. Реакцията е задължително придружена от серум и антигенен контрол. В случаите, когато се извършва подробна реакция на аглутинация в епруветка за серологично идентифициране на патогена, тя има диагностична стойност, ако реакцията се оцени като положителна, когато диагностичният серум е разреден до поне половината от титъра.
Трябва да се има предвид, че при смесване на разтвори на хомоложни антигени и антитела не винаги се наблюдават видими прояви на реакцията на аглутинация. Утайка се образува само при определени оптимални съотношения на двата компонента на реакцията. Извън тези граници, при значителен излишък на антиген или антитела, не се наблюдава реакция. Това явление се нарича „прозонов феномен“. Наблюдава се както при реакцията на аглутинация, така и при реакцията на утаяване. Появата на прозона в имунните реакции се обяснява с факта, че участващите в тях антигени като правило са полидетерминантни, а молекулите IgG антителаимат два активни центъра. При излишък от антитела повърхността на всяка антигенна частица е покрита с молекули на антитела, така че не остават свободни детерминантни групи, така че вторият, несвързан активен център на антителата не може да взаимодейства с друга антигенна частица и да ги свърже един с друг. Образуването на видим аглутинат или преципитат също се потиска, когато има излишък от антиген, когато не остава нито един свободен активен център на антителата и следователно комплексите антиген + антитяло + антиген вече не могат да се увеличават.
Възможности за ускорени реакции на аглутинация. реакция пасивна хемаглутинацияи неговите варианти
Класическата реакция на аглутинация включва използването на корпускулярни антигени. Въпреки това могат да бъдат включени и разтворими антигени. За да стане това възможно, такива антигени се адсорбират върху имунологично инертни частици. Частиците от латекс или бентонит могат да се използват като носител, но в момента най-често се използват животински или човешки еритроцити, подобрявайки техните адсорбиращи свойства чрез третиране с разтвори на танин, формалин или бензидин. Червените кръвни клетки, които са адсорбирали антиген върху себе си, се наричат сенсибилизирани от този антиген и имунна реакцияв която участват, е индиректна или пасивна реакция на хемаглутинация (IRHA или RPHA), тъй като червените кръвни клетки участват в нея пасивно.
RPGA се поставя в специални полистиренови плочи с отвори с полусферично дъно. Когато се използва за серологична диагностика, в тези ямки се приготвят двукратни разреждания физиологичен разтвортестов серум и след това към него се добавя суспензия от сенсибилизирани еритроцити като диагностичен агент. Резултатите се записват след 2 часа инкубиране при 37 °C, като се използва системата с четири кръста. При положителна реакция аглутинираните червени кръвни клетки се утаяват на дъното на дупката и я покриват равномерно под формата на обърнат чадър. Ако реакцията е отрицателна, червените кръвни клетки също се утаяват, течността става бистра и утайката изглежда като малък „диск“ в центъра на ямката. Серумният титър в RPHA се счита за последното му разреждане, което все още дава изразена хемаглутинация без значими знациналичието на "диск".
RPGA може да се използва и като ускорен метод за бактериологична диагностика за откриване директно в тестовия материал на неизвестни бактерии, вируси, токсини, например патогени на чума, стафилококови ентеротоксини и др. С тази версия на RPGA еритроцитите, които са адсорбирани, известни със своите специфичност се използват като известен компонент на реакцията антитела - антитяло еритроцит диагностикум. Ако тестовият материал съдържа достатъчно количество от известен антиген, RPGA ще бъде положителен.
Възможностите за използване на RPHA са: реакция на неутрализация на антигена (RNAg), реакция на неутрализация на антитела (RNAb), реакция на инхибиране на пасивната хемаглутинация (PHA). За тези реакции се използва еритроцитна диагностика на антигени и антитела. Две взаимно контролиращи се еднопосочни реакции могат да се използват едновременно, например RPHA с антигенен диагностикум и RNAg с антитяло еритроцитен диагностикум.
Реакцията на неутрализация на антитела (RNAb) се състои от смесване на суспензия, съдържаща желания антиген със специфичен имунен серум, съдържащ известни антитела в подходящи обеми и инкубиране при 37 °C в продължение на два часа. След това се добавя антигенен еритроцитен диагностикум. Сместа се разклаща и се оставя на стайна температура. Резултатите се вземат предвид след 3-4 часа и накрая след 18-24 часа.Ако тестовият материал съдържа антиген, той ще свърже антителата (неутрализира ги) и следователно няма да настъпи хемаглутинация.
Реакцията на неутрализация на антиген (RNAg) се извършва по същия принцип. Само в този случай се откриват антитела в тестовия материал. Специфичен антиген, добавен към такъв тестов материал, ще се свърже с антителата, съдържащи се в него, т.е. ще настъпи неутрализиране на антигена от антитела и следователно няма да настъпи хемаглутинация при добавяне на антитяло еритроцитна диагностика.
Реакция на коаглутинация. Това е един от вариантите за пасивна, т.е. ускорена реакция на аглутинация върху стъкло, медиирана от клетки, носители на антитела. Тази реакция се основава на уникален имот Стафилококус ауреус, който съдържа протеин А в клетъчната си стена, се свързва с Fc фрагментите на IgG и IgM. В този случай активните центрове на антителата остават свободни и могат да взаимодействат със специфични детерминанти на антигени. Капка от 2% суспензия на стафилококи, сенсибилизирани с подходящи антитела, се нанася върху предметно стъкло и се добавя капка суспензия от изследваната бактерия. Ако антигенът съвпада с антителата, в рамките на 30-60 s настъпва ясна аглутинация на заредените с антитела стафилококи.
Реакция на латекс аглутинация (LAR). Носителят на антителата в тази диагностична система са малки стандартни латексови частици. Реакцията се извършва по микрометод в ямки върху стъкло. Основното условие за успешно стадиране на ПАХ е стриктното спазване на количествените съотношения на компонентите на системата: 10 μl латексов препарат, сенсибилизиран с антитела, се добавя към 50 μl от тестовия материал. Специфичността на ПАХ се контролира с помощта на три контролни теста, съдържащи се в търговски системи за тестване: известна положителна реакция, известна отрицателна реакция и качествен контрол на латексови суспензии, като се използват нечувствителни към ПАХ (неносещи антитела) латекси с тестовия материал. У нас като носители на специфични антитела се използват полистиролови монодисперсни латекси с различен диаметър на частиците (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG се използва за бързо откриване на микроорганизми или техните антигени в тестовия материал.
Имуномагнитно откриване на антигени. Един от вариантите за ускорена реакция на аглутинация върху стъкло е свързан с използването на супермагнитни полимерни частици, покрити със специфични антитела. Една такава частица свързва до 107-108 клетки от микроорганизми, поради което чувствителността този методдостига 5 CFU/ml. Имуномагнитното откриване на микроорганизми може да се използва в комбинация с CPR.
Реакция на агрегатна хемаглутинация (AHA). Позволява ви бързо да откриете в кръвта на пациенти както свободно циркулиращи антигени (антигенемия), така и антигени, свързани с антитела - циркулиращи имунни комплекси (CIC). За RAHA се използват червени кръвни клетки, сенсибилизирани с подходящи антитела. Добавянето на кръвен серум на пациента, който съдържа антигени, към сенсибилизирани еритроцити, върху които са фиксирани антитела, води до слепване (аглутинация) на еритроцити и имунни комплекси.
Антиглобулинов тест на Coombs (реакция на R. Coombs). Пълните (двувалентни) антитела се определят чрез директни и пасивни реакции на аглутинация. Непълните (едновалентни, блокиращи) антитела не се откриват с тези методи, тъй като, когато се комбинират с антигена, те го блокират, но не могат да причинят агрегация на антигена в големи конгломерати. Непълни (блокиращи) антитела са тези, при които функционира само един активен център; вторият активен център не работи по неизвестна причина. За откриване на непълни антитела се използва специална реакция на Coombs (фиг. 72). Реакцията включва: серум на пациента, в който се определят непълни антитела, корпускуларен антиген-диагностикум, антиглобулинов серум, съдържащ антитела срещу човешки глобулин. Реакцията протича на два етапа:
Взаимодействие на антиген с непълни антитела. Няма видими прояви. Първият етап завършва чрез измиване на антигена от останалия серум на пациента.
Взаимодействие на антиглобулинов серум, получен в резултат на имунизация на животно с човешки глобулин с непълни антитела, адсорбирани върху антигена. Поради факта, че антиглобулиновите антитела са двувалентни, те свързват две моновалентни антитела на отделни AG + комплекси непълно антитяло, което води до слепването им и появата на видима утайка.
Съдържание на темата "Имуномодулатори. Имунодиагностика на инфекциозни заболявания.":Подробна реакция на аглутинация (RA). За определяне на AT в кръвния серум на пациента, a екстензивна реакция на аглутинация (RA). За да направите това, към серия от разреждания на кръвен серум се добавя диагностикум - суспензия от убити микроорганизми или частици със сорбиран Ag. Максималното разреждане дава аглутинация Ag се нарича серумен титър.
Видове реакции на аглутинация (RA) за откриване на АТ - кръвен капков тест за туларемия (с диагностикум, приложен към капка кръв и поява на видими белезникави аглутинати) и тест на Хъдълсън за бруцелоза (с диагностикум, оцветен с тинтява виолет, приложен към капка кръв серум).
Приблизителна реакция на аглутинация (RA)
За идентифициране на изолираните микроорганизми, приблизителна RA се поставя върху предметни стъкла. За да направите това, към капка стандартен диагностичен антисерум (разреден 1:10, 1:20) се добавя патогенна култура. Ако резултатът е положителен, се извършва подробна реакция с нарастващи разреждания на антисерума.
реакциясе счита за положителен, ако се наблюдава аглутинация в разреждания, близки до титъра на диагностичния серум.
OAS. Соматични O-Agsса топлоустойчиви и издържат на кипене в продължение на 2 ч. При взаимодействие с АТ образуват дребнозърнести агрегати.
N-Ag. N-Ag (флагелати)са термолабилни и бързо се разграждат при 100 °C, както и под въздействието на етанол. При реакции с H-антисерум, след 2 часа инкубация, се образуват рехави големи люспи (образувани от бактерии, залепнали заедно с флагели).
Ви-Артифоидната бактерия е относително устойчива на топлина (издържа на температури от 60-62 °C за 2 часа); При инкубиране с Vi антисерум се образува финозърнест аглутинат.
Реакции на директна хемаглутинация
Най-простият от тях реакции - аглутинациячервени кръвни клетки или хемаглутинация, използвани за определяне на кръвни групи в системата ABO. За определяне аглутинация(или липса на такъв) използвайте стандартни антисеруми с анти-А и анти-В аглутинини. Реакцията се нарича директна, тъй като изследваните Ag са естествени компоненти на червените кръвни клетки.
Среща се с директна хемаглутинациявирусната хемаглутинация има механизми. Много вируси са способни спонтанно да аглутинират еритроцитите на птици и бозайници; добавянето им към суспензия от еритроцити предизвиква образуването на агрегати от тях.
