מחקרים וירולוגיים הם מחקרים שנועדו לבודד וירוסים ולחקור את תכונותיהם, כמו גם לבסס את הקשר האטיולוגי של וירוסים עם מחלות מסוימות.

חומר למחקר נלקח בהתאם למקומם של הנגיפים השולטים בגוף המטופל ובמסלולי שחרורם במהלך סביבה חיצונית. החומר נאסף במיכלים סטריליים, מועבר למעבדה במהירות האפשרית ומאוחסן קפוא או על קרח עד לבדיקה. לפני השימוש, החומר לבידוד וירוס מעובד (ו) כדי לדכא מיקרופלורה זרה ומעובד להסרת חלקיקים גדולים.

נגיפים מבודדים על ידי הדבקת חיות מעבדה, עוברי תרנגולת ותרביות רקמה בחומר המכיל וירוסים. בחירת שיטת הבידוד תלויה בגורם החשוד כגורם למחלה. לפיכך, נעשה שימוש בתרביות רקמה (ראה) כאשר עובדים עם וירוסים שאינם פתוגניים עבור חיות מעבדה, או כאשר הם מתגלים בתרבית רקמה מוקדם יותר מאשר בהדבקה של בעלי חיים. עוברי תרנגולות נדבקים כדי לבודד פתוגנים, חזרת זיהומית (בחלל השפיר והאלנטואי), (בשק החלמון), אבעבועות שחורות (בממברנה הכוריואלנטואית).

בקרב חיות מעבדה, עכברים לבנים משמשים לרוב לבידוד וירוסים, ואחריהם ארנבות, חולדות, שרקנים, קופים. עבור arboviruses, היעיל ביותר הוא החדרת חומר המכיל וירוסים לראש או, עבור וירוסים פנאומוטרופיים, אל הקרום הרירי. דרכי הנשימה, לנגיפי אבעבועות שחורות, - על קרנית מצולקת.

בידוד וירוסים יעיל ביותר בתקופה החריפה של המחלה. נקודה מהותית בביסוס האופי הנגיפי של המחלה הן התוצאות מחקרים סרולוגייםסרה שנלקחה שוב ושוב מאותו חולה בתחילת המחלה ובתקופת ההבראה. גילוי נוגדנים לנגיפים המבודדים בסרום השני בטיטר שגדול פי 4 או יותר מאשר בסרום הראשון מעיד על קשר אטיולוגי של הנגיפים למחלה זו.

מוקדם ו שיטה מהירהזיהוי אנטיגנים נגיפיים היא שיטה של ​​נוגדנים פלואורסצנטיים, המבוססת על קיבוע ספציפי של נוגדנים מסומנים פלואורכרום על פני האנטיגן. האנטיגן מתגלה בקלות במיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה) בשל הקרינה הבהירה של נוגדנים הנספגים על האנטיגן. שיטת הנוגדנים הפלורסנטיים משמשת לבדיקת מריחות שנלקחו ממטופלים, קטעים היסטולוגיים של רקמות נגועות ותכשירים לתרבית רקמה. הם משמשים גם לזיהוי גופים יסודיים (ויריון) (ראה). בין שאר השיטות המורפולוגיות, נעשה שימוש בשיטות המזהות תכלילים ויראליים תוך תאיים בקטעים של איברים ורקמות מושפעות. איתור תכלילים מעיד על זיהום ובמקרים מסוימים תורם לאבחון מחלה ויראלית. לאיתור נוגדנים ויראליים בדם של חולים ולחקור מבנה אנטיגנינעשה שימוש בווירוסים שונים. תגובת הנטרול משמשת כמעט לכל הזיהומים הנגיפים. היא מבוססת על יכולתם של נוגדנים חיסוניים לנטרל את התכונות המדבקות של וירוסים כאשר התערובת מוכנסת לגוף של בעלי חיים רגישים או לתרבית רקמה. כדי לקבוע את מדד הנטרול, מערבבים מינון קבוע של סרום עם דילולים שונים של וירוסים, וכדי לקבוע את טיטר הנוגדנים - דילולים שוניםסרום עם מינון קבוע של וירוסים. השליטה היא הדבקה של בעלי חיים (או תרבית רקמה) בתערובת של וירוסים עם סרום תקין או עם תמיסת מלח. תגובת הנטרול מתבצעת לא רק כדי לזהות נוגדנים, אלא גם כדי לקבוע את סוג וסוג הנגיפים.

תגובת קיבוע המשלים [לדוגמה, תגובת Bordet-Giangou (ראה)] משמשת לזיהוי גם אנטיגנים ויראליים וגם נוגדנים. במקרה הראשון, התגובה כרוכה באינטראקציה של סרום חיסוני ידוע וחומר בו מניחים נוכחות של אנטיגנים: סרום דם, משטחי אף-לוע, תמציות רקמות של אורגניזם נגוע. במקרה השני - אנטיגן ידוע (דיאגנוסטיקום) וסרום של החולה או מחלים.

RSK משמש לאבחון מחלות הנגרמות על ידי נגיפי שפעת, נגיפי אבעבועות שחורות, אדנו-וירוסים ו-arboviruses.

עבודה בקורס

"שיטות של וירולוגיה קלינית"

מבוא

אבחון מעבדה זיהום ויראלימתבצע בעיקר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני, תרביות תאים רגישות ושיטות אימונולוגיות. ככלל, שיטה אחת נבחרת לביצוע אבחנה בהתאם לשלב הזיהום הנגיפי. לדוגמה, כל שלוש הגישות עשויות להיות שימושיות באבחון אבעבועות רוח, אך השימוש המוצלח במיקרוסקופיה ובטכניקות תרבית תאים תלוי ביכולת לאסוף דגימות משביעות רצון בשלב מוקדם יחסית של המחלה.

הצלחה במידה רבה אבחון ויראליתלוי באיכות הדגימות שהתקבלו. מסיבה זו, צוות המעבדה עצמו חייב להיות מעורב ישירות באיסוף הדגימות הדרושות. מאפייני הדגימות, כמו גם שיטות מסירתן למעבדה, מתוארים על ידי Lennett, Schmidt, Christ, et al.

את רוב הריאגנטים והמכשירים המשמשים באבחון מעבדה ניתן לרכוש מחברות שונות. ברוב המקרים, אותו ריאגנט מיוצר בו זמנית על ידי מספר חברות. מסיבה זו, לא ציינו חברות בודדות, אלא אם המגיב מסופק על ידי חברה אחת בלבד. בכל שאר המקרים, עליך לפנות רשימה כלליתספקים המפורטים בטבלה. 1.

לא שאפנו לספק תיאור מקיף של כל השיטות הקיימות כיום לאבחון זיהומים ויראליים אנושיים. קודם כל, אפינו את השיטות העיקריות. ככל שאתה צובר ניסיון עבודה עצמאיתניתן להשתמש בטכניקות הבסיסיות הללו כדי לפתור בעיות מורכבות יותר.

1. מיקרוסקופ אלקטרוני

לאבחון מיקרוסקופי אלקטרוני של זיהומים ויראליים, ניתן להשתמש בחלקים דקים של רקמה מושפעת. החומר הנפוץ ביותר המשמש למיקרוסקופ אלקטרוני הוא צואה או נוזל.

טבלה 1. רשימת חברות המספקות ריאגנטים וציוד

שלפוחיות המאפיינות מחלות מסוימות, כמו אבעבועות רוח. כאשר מנתחים חומר כזה, ניתן לזהות וירוסים באמצעות צביעה שלילית, אשר מביאה לחומר צפוף אלקטרונים המתאר את מרכיבי הוויריון. השיטה יעילה כאשר ריכוז הנגיף גבוה בדגימות הבדיקה, כמו בצואה או בנוזל שלפוחית. במקרים בהם תכולת חלקיקי הנגיף בדגימות נמוכה, ניתן להגדיל את ההסתברות לגילוי הנגיף על ידי ריכוז הנגיף על ידי אולטרה צנטריפוגה או על ידי צבירה שלו עם נוגדנים ספציפיים. השיטה האחרונה נוחה גם לזיהוי וירוסים. כאן אנו מתארים שיטת אבחון מיקרוסקופית אלקטרונית זיהום בנגיף הרוטהוהשיטה של ​​מיקרוסקופיה אימונואלקטרון תוך שימוש בדוגמה של זיהוי נוגדנים ספציפיים ל-parvoviruses. שיטות מיקרוסקופיה אלקטרוניות מתוארות ביתר פירוט על ידי Field.

2.1 בדיקה אלקטרונית מיקרוסקופית ישירה של צואה

1. טובלים את קצה פיפטת פסטר בצואה ושואפים מספיק חומר כדי להשיג מריחה של 1 ס"מ.

2. השהה מחדש את כתם הצואה בצבע ניגוד שלילי אלקטרוני מיקרוסקופי עד לקבלת תרחיף שקוף. צבע ניגוד שלילי הוא תמיסה של 2% של חומצה פוספוטונגסטית במים מזוקקים.

3. כדי להשיג דגימה מיקרוסקופית אלקטרונית, מניחים טיפה מהתרחיף על רשת מיקרוסקופיה אלקטרונית מצופה בסרט פחמן-formvar. במהלך פעולה זו מחזיקים את הרשת בעזרת זוג פינצטה דקה.

4. משאירים את התרופה באוויר למשך 30 שניות.

5. עודפי נוזלים מוסרים על ידי נגיעה בקצה הכוס בנייר סינון.

6. התרופה מיובשת באוויר.

7. במידת הצורך, הנגיף בר-קיימא מושבת על-ידי הקרנת שני צידי הרשת באור אולטרה-סגול בעוצמה של 440,000 μW-s/cm2. במקרה זה, נעשה שימוש במנורת אולטרה סגול עם גל קצר עם מסנן. המנורה צריכה להיות במרחק של 15 ס"מ מהרשת; זמן ההקרנה לכל צד הוא 5 דקות.

8. ניתן לאפיין וירוסים של רוטה וירוסים תחת מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת עם הגדלה של 30,000 עד 50,000.

2.2 מיקרוסקופיה אימונואלקטרון

שיטת מיקרוסקופיה אימונואלקטרון המתוארת להלן היא רק אחת משיטות אימונולוגיות דומות רבות. לחקר נוגדנים ספציפיים לווירוס, בנוסף, משתמשים בשיטה הכוללת קישור לרשת המיקרוסקופית של חלבון A. ריכוז העבודה של נוגדנים אנטי-ויראליים נקבע בניסוי וטעייה בטווח שבין 1/10 ל-1/1000. הריכוז שאנו מציינים משמש בדרך כלל בעבודה שגרתית. כדי להשיג תוצאות אופטימליות לאינטראקציה של נוגדנים עם הנגיף, סרום המכיל parvovirus עובר טיטרציה באותו אופן.

1. 10 µl של אנטי-סרום ל-parvovirus אנושי מדולל 100 פעמים עם PBS. התמיסה מחוממת באמבט מים ל-56 מעלות צלזיוס.

2. ממיסים 10 מ"ל של 2% אגרוז ב-PBS באופן הרגיל ומצננים ל-56 מעלות צלזיוס באמבט מים.

3. ב-56 מעלות צלזיוס, ערבבו 1 מ"ל של אנטי-סרום מדולל עם 1 מ"ל של 2% אגרוז.

4. העבירו 200 μl מהתערובת שהתקבלה לשתי בארות של צלחת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות.

5. נותנים לאגרוז להתייצב בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את הטבליה ב-4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות אם היא אטומה בנייר דבק.

6. הוסף 10 μl של סרום המכיל parvovirus לבאר המכילה תערובת של אגרוז ואנטי-סרום.

7. רשת מיקרוסקופיה אלקטרונית עם ציפוי פחמן-formvar שהוכן מראש מונחת בצד הפחות מבריק על טיפת סרום.

8. הרשת נשמרת במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח.

9. בעזרת פינצטה דקה מוציאים את הרשת ומורחים טיפה של חומצה פוספוטונגסטית 2% על פני הרשת שהיו במגע עם הסרום.

10. לאחר 30 שניות שוטפים את עודפי הצבע, מייבשים את התכשיר ומשביתים את הנגיף.

חלקיקים נגיפיים מצטברים נבדקים תחת מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת בהגדלה של 30,000 עד 50,000.

3. זיהוי אנטיגנים ויראליים

ניתן לזהות וירוסים המצויים ברקמות או בנוזלי רקמה על ידי חלבונים ספציפיים לווירוס באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדנים. התוצר של תגובת האנטיגן-נוגדן נבדק כנגד תג המוכנס ישירות לנוגדנים אנטי-ויראליים או לנוגדנים המכוונים נגד נוגדנים ספציפיים לווירוס. נוגדנים יכולים להיות מסומנים עם פלואורסין, יוד רדיואקטיבי או אנזים שמבקע את המצע וגורם לשינוי צבע. בנוסף, תגובת ההמגלוטינציה משמשת לזיהוי הנגיף. בתרגול היומיומי, השיטות המתוארות משמשות בעיקר לאיתור אנטיגנים של וירוס הפטיטיס B בדם וחיפוש אחר אנטיגנים של וירוסים שונים הגורמים למחלות שונות בדרכי הנשימה.

נכון להיום, חברות רבות מייצרות אבחון אריתרוציטים, רדיואקטיביים ואנזימטיים, לרבות כאלה לגילוי נגיף הפטיטיס B. איננו רואים רצוי להתוות שיטות לעבודה עם אבחון אלו: די לעקוב אחר ההוראות המצורפות. להלן נתמקד בשיטת האימונופלואורסצנציה לזיהוי וירוס סינציטיאלי נשימתי בהפרשות האף-לוע.

3.1 זיהוי נגיף סינציציאלי נשימתי בהפרשות האף-לוע באמצעות אימונופלואורסצנטי

השיטה להשגת תכשירים של הפרשות מהאף מתוארת על ידי גרדנר ומקווילין. IN תנאי מעבדהפעולה זו מתבצעת בשני שלבים. ראשית, מכינים מריחה של ריר האף-לוע על שקופית זכוכית. את המריחות המתקבלות ניתן לאחסן קבוע ב-20 מעלות צלזיוס למשך חודשים רבים. בשלב השני צובעים מריחות כדי לזהות את אנטיגן הנגיף הסינסציאלי הנשימתי. לשם כך, נעשה שימוש בשיטה של ​​אימונופלואורסצנטי עקיף.

3.1.1 הכנת תכשירים של הפרשות מהאף

1. ריר ממלקחיים מיוחדים נשטף עם 1-2 מ"ל של PBS ומועבר לצינור צנטריפוגה.

2. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב-1500 סל"ד בצנטריפוגה שולחנית.

3. הסופרנטנט מרוקן.

4. גלולת התא מושהה מחדש בזהירות ב-2-3 מ"ל של PBS עד לקבלת השעיה הומוגנית. לשם כך, השתמש בפיפטת פסטר רחבת צוואר.

5. התרחיף שנוצר מועבר למבחנה.

6. הוסף עוד 2-4 מ"ל של PBS לתרחיף וערבב על ידי פיפטינג. קרישי ריר גדולים מוסרים.

7. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב-1500 סל"ד בצנטריפוגה שולחנית.

8. הסופרנטנט מושלך, המשקעים מורחקים מחדש בנפח כזה של PBS שההשעיה שנוצרה מופרדת בקלות מדפנות הצינור.

9. ההשעיה שהתקבלה מוחלת על שקופית זכוכית מסומנת.

10. הכוס מיובשת באוויר.

קבע באציטון למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

12. לאחר הקיבוע, הכוס מיובשת שוב באוויר.

13. התכשירים המתקבלים נצבעים מיד או מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס.

3.1.2. טכניקת צביעה

1. הדפס ודלל אנטי-סרום מסחרי של RSV ב-PBS לריכוז העבודה המומלץ.

2. בעזרת פיפטת פסטר, מרחו טיפה אחת של אנטי-סרום על התכשיר המוכן.

3. התרופה מונחת בתא לח.

4. התרופה מודגרת למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

5. דגימות נשטפות בזהירות עם PBS כדי להסיר עודפי נוגדנים במאגר מיוחד.

6. הדגימות נשטפות בשלוש משמרות של PBS, 10 דקות כל אחת.

7. יבש את הדגימות, הסר עודפי PBS עם נייר סינון ויבש באוויר.

מחקר לאבחון מחלות בעלות אופי ויראלי. זה הכרחי כדי לזהות את הנגיף, ללמוד את הביולוגיה שלו ואת יכולתו להשפיע על תאים של בעלי חיים ובני אדם. לפיכך, ניתן להבין את הפתוגנזה מחלות ויראליותובהתאם, בחר את שיטת הטיפול הנכונה.

מה האבחנה?

בתאים חיים. כדי ללמוד אותו, יש צורך לטפח אותו ברמה של אורגניזם ניסיוני או למטרה זו ב פרקטיקה רפואיתומיקרוביולוגיה בכלל, מתבצעות שיטות מחקר וירולוגיות, בעלות הגישות העיקריות הבאות:

• יָשָׁר;
• עקיף;
• סרולוגי.

ניתן לבחון את החומר ישירות לנוכחות חומצות גרעין, אנטיגן ויראלי, או למשל לבודד ולזהות את הנגיף מחומר קליני.

בנוסף ליכולת לבסס את האטיולוגיה של המחלה, ניטור השפעה טיפולית, שיטות מחקר וירולוגיות ממלאות תפקיד גדול באמצעים נגד מגיפה. עוברי עוף, חיות מעבדה או תרביות תאים משמשים לבידוד.

איך זה נחקר?

המהירה ביותר היא השיטה הישירה. זה מאפשר לך לזהות וירוס, אנטיגן או NA (חומצת גרעין) בחומר הקליני עצמו. זה לוקח בין שעתיים ליום.

1. EM - מיקרוסקופיה אלקטרונית. מזהה את הנגיף ישירות.
2. IEM - מיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. משתמש בנוגדנים ספציפיים לווירוסים.
3. RIF - תגובה אימונופלואורסצנטית. משתמש בנוגדנים הקשורים לצבע. שיטות מחקר וירולוגיות כאלה נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח במהירות את האטיולוגיה של ARVI (זיהומים נגיפיים חריפים בדרכי הנשימה), כאשר נלקחות מריחות טביעות אצבע מהקרום הרירי של דרכי הנשימה העליונות.
4. ELISA - אנזים-linked immunosorbent assay - קביעת אנטיגנים ויראליים, בדומה ל-RIF, אך מבוססת על סימון נוגדנים באנזימים.
5. RIA - בדיקת רדיואימונו. משתמש בסימון רדיואקטיבי של נוגדנים כדי לספק רגישות גבוהה בזיהוי אנטיגן ויראלי.
6. מולקולרית - הכלאה של NK או בידוד של גנומים וירוסים באמצעות PCR (פולימראז תגובת שרשרת).
7. ציטולוגיה משמשת לעתים רחוקות, אך עבור זיהומים מסוימים שיטות מחקר וירולוגיות אלו יעילות מאוד. נבדקים חומרי ביופסיה, נתיחות ומריחות המעובדות לצביעה וניתוח במיקרוסקופ.

מה הטעם במחקר?

כדי לבודד בהצלחה וירוסים, חומר קליני נלקח בהתאם לפתוגנזה ובמוקדם ככל האפשר. לעתים קרובות תהליך זה דורש מספר קטעים לפני יישום שיטות מחקר וירולוגיות מסוימות.

מיקרוביולוגיה היא חקר יצורים מיקרוסקופיים. והתחום שלה הוא לא רק רפואה. זה המדע הבסיסי עבור חַקלָאוּת, רפואה וטרינרית, חלל ותעשיות טכניות, גיאולוגיה.

אבל כמובן שהכל נוצר למען האדם והתפתחותו על הפלנטה היפה הזו. לכן, חשוב מאוד לזהות את הסכנה בזמן ולנטרל אותה. וירוסים שונים מחיידקים. אלו מבנים שנכנסים לגוף וגורמים להיווצרות דור חדש. הם נראים כמו גבישים ומכוונים לשלוט בתהליך הרבייה שלהם, למרות שהם עצמם אינם ניזונים, אינם גדלים ואינם מפרישים תוצרים מטבוליים.

הנגיף יכול לגרום מחלה רציניתבכל אורגניזם חי שאליו הוא נכנס. בנוסף, זה יכול להתפתח. לכן יש לפתח ולשפר שיטות מחקר וירולוגיות במיקרוביולוגיה, שכן הציוויליזציה האנושית כולה עלולה להיות תחת איום.

חומרים

כדי לזהות ולזהות וירוסים ברפואה, ככלל, נלקחים הבאים:

• שטיפה באף הלוע ( זיהומים בדרכי הנשימה);
• סומק וצואה ( זיהומי enterovirus);
• גרידות, תוכן של שלפוחיות (נגעים בעור, ריריות, כמו הרפס, אבעבועות רוח);
• סמקים (זיהומים אקסנטמנטליים כגון חצבת, אדמת);
• דָם, נוזל מוחי(זיהומים ארבו-וירוס).

שלבים

כל השלבים של שיטת המחקר הווירולוגית כוללים:

• איסוף חומר;
• בחירה, השגת מערכת בדיקה, קביעת הכדאיות שלה;
• זיהום של מערכת הבדיקה;
• אינדיקציה לנגיף;
• קביעת סוג הנגיף.

בעיקרון, וירוסים פתוגניים שונים בנוכחות ספציפיות של רקמה וסוג. קחו, למשל, את נגיף הפוליו, שמתרבה רק בפרימטים (בתאים שלהם). בהתאם לכך, תרבית רקמה ספציפית משמשת לבידוד נגיף ספציפי. אם אנחנו מדברים עללגבי פתוגן לא ידוע, רצוי להדביק בו זמנית שלוש, או עדיף ארבע, תרביות תאים.

לפיכך, אולי אחד מהם יהיה רגיש. כדי לקבוע נוכחות של נגיף בתרביות נגועות, הם בוחנים התפתחות של ניוון תאים ספציפי, תכלילים תוך-תאיים, זיהוי של אנטיגן ספציפי, תגובות המגלוטינציה חיוביות וספיחה של המד.

יש לבחור את כל שיטות המחקר הווירולוגיות (ישירות ועקיפות, סרולוגיות) כמתאימות ביותר למקרה הספציפי של חשד לזיהום.

שיטות עקיפות מבוססות על בידוד וזיהוי של הנגיף. הם עתירי עבודה, גוזלים זמן, אך מדויקים.

סרודיאגנוזיס

אבחנה זו מתייחסת לשיטה המבוססת על תגובת אנטיגן-נוגדן. לרוב, נעשה שימוש בסרחי דם מזווגים, הנלקחים במרווחים של מספר שבועות. אם טיטר הנוגדנים גדל פי 4 או יותר, התגובה נחשבת חיובית. כדי לקבוע את סגוליות הסוג של הנגיף, נעשה שימוש בתגובת נטרול וירוס. כדי לקבוע את הספציפיות של הקבוצה, יש צורך להשיג תגובה של קיבוע משלים.

וריאנטים שונים של בדיקת אנזים אימונו, תגובות עיכוב המגלוטינציה, המאגלוטינציה פסיבית, hemagglutination פסיבי הפוכה, RIF. גם ב הנדסה גנטיתפותחה שיטה לייצור נוגדנים חד שבטיים. ניתן להתגבר על הספציפיות הצרה של מונוקלונים על ידי שימוש במספר נוגדנים חד שבטיים לדטרמיננטים ויראליים שונים. לפיכך, הספציפיות והרגישות של מבחן גילוי האנטיגן הוגדלו.

כמה מאפיינים

כיום נוצרו מערכות בדיקה רבות ושונות לאבחון אימונולוגי של זיהומים הנובעים מחדירת נגיף לאורגניזם חי.

לפיכך, שיטות מחקר וירולוגיות הן שיטות לבידוד נגיפים, לימוד תכונותיהם וביסוס הקשר האטיולוגי שלהם עם מחלות מסוימות.

המחקר הווירולוגי כולל שני שלבים עיקריים: בידוד נגיפים וזיהוים. החומר למחקר וירולוגי יכול להיות דם, נוזלים ביולוגיים ופתולוגיים אחרים, ביופסיות של איברים ורקמות.

בדיקות דם וירולוגיות מבוצעות לעתים קרובות כדי לאבחן זיהומים ארבו-ויראליים. נגיפי כלבת יכולים להימצא ברוק, חַזֶרֶת, הרפס סימפלקס, משטחי אף-לוע משמשים לבידוד פתוגנים של שפעת וזיהומים ויראליים חריפים אחרים בדרכי הנשימה, חצבת. אדנוווירוסים מתגלים בספוגיות הלחמית. נגיפי entero-, adno-, pso-, nora- ורוטה שונים מבודדים מהצואה.

כדי לבודד וירוסים משתמשים בתרביות תאים, עוברי תרנגולות ולפעמים בחיות מעבדה.

רוב הנגיפים הפתוגניים נבדלים על ידי נוכחות של רקמה וסוג ספציפיות; למשל, וירוס הפוליו מתרבה רק בתאי פרימטים, ולכן משתמשים בתרבית רקמה מתאימה לבידוד וירוס ספציפי. כדי לבודד פתוגן לא ידוע, רצוי להדביק בו זמנית 3-4 תרביות תאים, בהנחה שאחת מהן עשויה להיות רגישה. נוכחות הנגיף בתרביות תאים נגועים נקבעת על ידי התפתחות של ניוון תאים ספציפי, כלומר. פעולת ציפטוגן, זיהוי תכלילים תוך תאיים, וכן על בסיס זיהוי של אנטיגן ספציפי על ידי אימונופלואורסצנטי, ספיחה חיובית של המד וספיגת תגובות hemagglutination.

עוברי ציפורים עם רקמות מובחנות בצורה גרועה מתאימים לטיפוח נגיפים רבים. רוב הזמן משתמשים בעוברי עוף. כאשר מתרבים בעוברים, נגיפים עלולים לגרום למותם (נגיפי ארבו), להופעת שינויים בקרום הכוריון-אלנטואי (נגיפי אבעבועות שחורות) או בגוף העובר, הצטברות גלוטן בנוזלים העובריים (נגיפי שפעת, חזרת). ) ואנטיגן ויראלי קושר משלים.

זיהוי וירוסים מתבצע באמצעות שיטות אימונולוגיות: תגובת עיכוב ההמגלוטינציה, קיבוע משלים, נטרול, משקעים ג'ל, אימונופלואורסצנטי.

עוד בנושא שיטה וירולוגית:

1. הערכת נתונים אנתרופומטריים בסיסיים בשיטה הפרמטרית (שיטת סיגמא)
2. טיפול בשיטת הכחדה של תקשורת מותנית ובשיטת האימון הכפוי
3. 2. שיטה משפטית השוואתית - שיטה מדעית פרטית למדעי המשפט
4. שיטות מודרניות לאבחון ובחירה של שיטת טיפול עבור שריר רחם תת-רירי
5. 5.4. הרעיון והמבנה של שיטת החקירה הכללית כשיטת פעילות מעשית
6. נושא 8. שיטות מיקרוביולוגיות לחקר שונות ומנגנוני העברת מידע תורשתי. יישום שיטות גנטיות ליצירת תרופות חדשות
7. נושא 15. פתוגניות וארסיות של מיקרואורגניזמים. גורמי וירוס. שיטות הדבקה של חיות מעבדה. אנטיגנים, שיטות להשגתן. נוגדנים. תגובות חסינות והשימוש המעשי בהן. פגוציטוזה

שיטות מחקר וירולוגיות

שיטות לחקר הביולוגיה של וירוסים וזיהוים. שיטות נמצאות בשימוש נרחב בווירולוגיה ביולוגיה מולקולרית, בעזרתם ניתן היה לבסס את המבנה המולקולרי של חלקיקים ויראליים, שיטות חדירתם לתא ותכונות של רבייה ויראלית, המבנה הראשוני של חומצות גרעין ויראליות וחלבונים. מפותחות שיטות לקביעת רצף המרכיבים המרכיבים של חומצות גרעין ויראליות וחומצות אמינו חלבוניות. ניתן לקשר בין הפונקציות של חומצות הגרעין והחלבונים שהן מקודדות לרצף הנוקלאוטידים ולבסס את הגורמים לתהליכים תוך-תאיים הממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה של זיהום ויראלי.

שיטות מחקר וירולוגיות מבוססות גם על תהליכים אימונולוגיים (אינטראקציה של אנטיגן עם נוגדנים), תכונות ביולוגיות של הנגיף (יכולת להמגלוטינציה, המוליזה, פעילות אנזימטית), תכונות של האינטראקציה של הנגיף עם התא המארח (אופי ההשפעה הציטופטית, היווצרות תכלילים תוך תאיים וכו').

באבחון זיהומים ויראליים, בגידול, בידוד וזיהוי וירוסים וכן בייצור תכשירי חיסון, נעשה שימוש נרחב בשיטת התרבית רקמות ותאים. נעשה שימוש בתרביות תאים ראשוניות, משניות, רציפות ודיפלואידיות יציבות. תרביות ראשוניות מתקבלות על ידי פיזור רקמה עם אנזימים פרוטאוליטיים (טריפסין, קולגנאז). מקור התאים יכול להיות רקמות ואיברים (בדרך כלל כליות) של עוברי אדם ובעלי חיים. תרחיף של תאים במדיום תזונתי ממוקם במזרנים, בקבוקים או צלחות פטרי כביכול, שם, לאחר החיבור אל פני הכלי, התאים מתחילים להתרבות. לזיהום בנגיף, בדרך כלל משתמשים בשכבת תאים. נוזל התזונה מרוקן, התרחיף הנגיפי מתווסף בדילולים מסוימים ולאחר מגע עם התאים מוסיפים מצע תזונה טרי, לרוב ללא סרום.

ניתן להתרבות את התאים של רוב התרבויות הראשוניות; תרבית כזו נקראת תרבות משנית. עם מעבר נוסף של תאים, נוצרת אוכלוסייה של תאים דמויי פיברובלסט, המסוגלת להתרבות מהירה, רובאשר שומר על מערכת הכרומוזומים המקורית. אלה הם מה שנקרא תאים דיפלואידים. על ידי תרבית סדרתית של תאים, מתקבלות תרביות תאים רציפות יציבות. במהלך המעברים, מופיעים תאים הומוגניים המתחלקים במהירות עם קבוצה הטרופלואידית של כרומוזומים. קווי תאים יציבים יכולים להיות חד-שכבתיים או השעיה. תרביות חד-שכבתיות גדלות בצורה של שכבה רציפה על משטח הזכוכית, בעוד שתרביות תרחיף גדלות בצורה של תרחיפים בכלים שונים באמצעות התקני ערבוב. יש יותר מ-400 שורות תאים הנגזרות מ-40 סוגים שוניםבעלי חיים (כולל פרימטים, ציפורים, זוחלים, דו-חיים, דגים, חרקים) ובני אדם.

ניתן לתרבת חתיכות במדיה תזונתית מלאכותית איברים בודדיםורקמות (תרביות איברים). סוגים אלה של תרביות משמרים את מבנה הרקמה, שחשוב במיוחד לבידוד ומעבר של וירוסים שאינם מתרבים בתרביות רקמה לא מובחנות (למשל, נגיפים).

בתרביות תאים נגועים ניתן לזהות וירוסים על ידי שינויים במורפולוגיה של התא, השפעות ציטופתיות, שעשויות להיות ספציפיות, הופעת תכלילים, על ידי קביעת אנטיגנים ויראליים בתא ובנוזל התרבית; ביסוס התכונות הביולוגיות של צאצאים נגיפיים בנוזל תרבית וטיטרציה של וירוסים בתרבית רקמה, עוברי עוף או בעלי חיים רגישים; על ידי זיהוי חומצות גרעין ויראליות בודדות בתאים על ידי הכלאה מולקולרית או הצטברויות של חומצות גרעין בשיטה ציטוכימית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בידוד וירוסים הוא תהליך עתיר עבודה וזמן רב. היא מתבצעת כדי לקבוע את סוג הנגיף או הווריאציה של הנגיף המסתובב בקרב האוכלוסייה (לדוגמה, לזהות סרווריאנט של נגיף השפעת, זן בר או חיסון של נגיף הפוליו וכו'); במקרים בהם יש צורך בביצוע צעדים אפידמיולוגיים דחופים; כאשר מופיעים סוגים או גרסאות חדשות של וירוסים; במידת הצורך, אשר את האבחנה המוקדמת; כדי לציין וירוסים בחפצים סביבה. בעת בידוד וירוסים, נלקחת בחשבון האפשרות של התמדה שלהם בגוף האדם, כמו גם התרחשות של זיהום מעורב שנגרם על ידי שני וירוסים או יותר. אוכלוסייה הומוגנית מבחינה גנטית של הנגיף המתקבלת מוויריון אחד נקראת שיבוט ויראלי, ותהליך השגתו נקרא שיבוט.

כדי לבודד וירוסים, משתמשים בהדבקה של חיות מעבדה רגישות ועוברי תרנגולות, אך לרוב משתמשים בתרבית רקמה. נוכחות נגיף נקבעת בדרך כלל על ידי ניוון תאים ספציפי (אפקט ציטופטי), היווצרות סימפלסטים וסינסיטיות, זיהוי תכלילים תוך-תאיים, כמו גם אנטיגן ספציפי שזוהה באמצעות אימונופלואורסצנציה, ספיחה המד, המאגלוטינציה (עבור נגיפים המגלוטינים) וכו' . ניתן לזהות סימנים אלו רק לאחר 2-3 מעברים של הנגיף.

כדי לבודד מספר וירוסים, כמו נגיפי שפעת, משתמשים בעוברי תרנגולות, וכדי לבודד כמה נגיפי קוקסאקי ומספר נגיפים ארבו, משתמשים בעכברים שזה עתה נולדו. זיהוי וירוסים מבודדים מתבצע באמצעות תגובות סרולוגיות ושיטות אחרות.

כאשר עובדים עם וירוסים, הטיטר שלהם נקבע. טיטרציה של וירוסים מתבצעת בדרך כלל בתרבית רקמה, תוך קביעת הדילול הגבוה ביותר של הנוזל המכיל את הנגיף שבו מתרחשת ניוון רקמות, נוצרים תכלילים ואנטיגנים ספציפיים לנגיף. ניתן להשתמש בשיטת הפלאק לטיטרציה של מספר וירוסים. פלאקים, או מושבות שליליות של וירוסים, הם מוקדים של תאים שנהרסו על ידי הנגיף בתרבית רקמה חד-שכבתית תחת ציפוי אגר. ספירת מושבות מאפשרת ניתוח כמותי של הפעילות המדבקת של וירוסים על בסיס שחלקיק וירוס מדבק אחד יוצר רובד אחד. פלאקים מתגלים על ידי צביעה של התרבית בצבעים תוך חיוניים, בדרך כלל אדום ניטרלי; הפלקים אינם סופחים את הצבע ולכן נראים ככתמים בהירים על רקע תאים חיים מוכתמים. טיטר הנגיף מבוטא כמספר היחידות היוצרות פלאק ל-1 ml.

טיהור וריכוז של וירוסים מבוצעים בדרך כלל על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ואחריה צנטריפוגה של גרדיאנט ריכוז או צפיפות. כדי לטהר וירוסים, נעשה שימוש בשיטות אימונולוגיות, כרומטוגרפיה של חילופי יונים, אימונוסורבנטים וכו'.

אבחון מעבדה של זיהומים ויראליים כולל איתור הפתוגן או מרכיביו בחומר קליני; בידוד הנגיף מחומר זה; serodiagnosis. בחירת שיטה אבחון מעבדהבכל מקרה לגופו תלוי באופי המחלה, בתקופת המחלה וביכולות המעבדה. אבחון מודרניזיהומים ויראליים מבוססים על שיטות אקספרס המאפשרות לקבל תשובה מספר שעות לאחר נטילת החומר הקליני דייטים מוקדמיםלאחר המחלה, אלה כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים ואלקטרונים חיסוניים, כמו גם אימונופלואורסצנטי, שיטת הכלאה מולקולרית, זיהוי נוגדנים מקבוצת IgM וכו '.

מיקרוסקופ אלקטרוני של וירוסים מוכתמים שלילי מאפשרת להבדיל בין וירוסים ולקבוע את ריכוזם. השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני באבחון זיהומים ויראליים מוגבל לאותם מקרים שבהם ריכוז החלקיקים הנגיפים בחומר קליני גבוה למדי (10 5 ב-1 mlוגבוה יותר). החיסרון של השיטה הוא חוסר היכולת להבחין בין וירוסים השייכים לאותה קבוצה טקסונומית. מחסור זה מתגבר על ידי שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית חיסונית. השיטה מבוססת על יצירת קומפלקסים חיסוניים על ידי הוספת סרום ספציפי לחלקיקים נגיפיים, ובו זמנית ריכוז החלקיקים הנגיפים, ומאפשר זיהוים. השיטה משמשת גם לאיתור נוגדנים. למטרות אבחון מפורש, מתבצעת בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונית של תמציות רקמות, צואה, נוזל שלפוחית ​​והפרשות מהאף. אלקטרון מיקרוסקופיבשימוש נרחב לחקר המורפוגנזה של הנגיף, יכולותיו מורחבות עם שימוש בנוגדנים מסומנים.

שיטת ההכלאה המולקולרית, המבוססת על זיהוי חומצות גרעין ספציפיות לווירוס, מאפשרת לזהות עותקים בודדים של גנים ואין לה אח ורע ברגישות. התגובה מבוססת על הכלאה של גדילי DNA או RNA משלימים (probes) ויצירת מבנים דו-גדיליים. הבדיקה הזולה ביותר היא DNA רקומביננטי משובט. הבדיקה מסומנת במבשרים רדיואקטיביים (בדרך כלל זרחן רדיואקטיבי). השימוש בתגובות קולורימטריות מבטיח. ישנן מספר אפשרויות להכלאה מולקולרית: הכלאה נקודתית, הכלאת כתמים, הכלאה של סנדוויץ', הכלאה במקום וכו'.

נוגדנים מקבוצת IgM מופיעים מוקדם יותר מנוגדנים מסוג G (ביום ה-3-5 למחלה) ונעלמים לאחר מספר שבועות, כך שזיהוים מצביע על זיהום לאחרונה. נוגדנים מקבוצת lgM מזוהים על ידי אימונופלואורסצנטי או על ידי בדיקת אנזים אימונו באמצעות אנטי-μ אנטיסרה (סרה נגד השרשראות הכבדות של lgM).

שיטות סרולוגיות בווירולוגיה מבוססות על תגובות אימונולוגיות קלאסיות (ראה שיטות מחקר אימונולוגיות) : תגובות קיבוע משלים, עיכוב המגלוטינציה, נטרול ביולוגי, דיפוזיה חיסונית, המאגלוטינציה עקיפה, המוליזה רדיאלית, אימונופלואורסצנטי, אנזים אימונואסאי, רדיואימוניות. פותחו מיקרו-שיטות לתגובות רבות, והטכניקות שלהן משתפרות כל הזמן. שיטות אלו משמשות לזיהוי וירוסים באמצעות קבוצה של סרום ידוע ועבור סרודאיגנוזיס כדי לקבוע את העלייה בנוגדנים בסרום השני בהשוואה לראשון (הנסיוב הראשון נלקח בימים הראשונים לאחר המחלה, השני - לאחר 2- 3 שבועות). ערך אבחוןיש עלייה של לפחות פי ארבע בנוגדנים בסרום השני. אם גילוי נוגדנים מקבוצת IgM מצביע על זיהום לאחרונה, אזי נוגדנים מקבוצת IgC נמשכים מספר שנים, ולעיתים לכל החיים.

כדי לזהות אנטיגנים בודדים של וירוסים ונוגדנים אליהם בתערובות מורכבות ללא טיהור מקדים של חלבונים, משתמשים באימונובלוטינג. השיטה משלבת חלוקה של חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם אינדיקציה חיסונית לאחר מכן של חלבונים בשיטת אנזימים אימונואסאי. הפרדת חלבונים מפחיתה את הדרישות לטוהר הכימי של האנטיגן ומאפשרת לזהות זוגות אנטיגן-נוגדנים בודדים. משימה זו רלוונטית, למשל, ב-serodiagnosis של זיהום ב-HIV, כאשר תגובות מבחני חיסון חיסוני מקושר-אנזימים חיוביים כוזבים נגרמות על ידי נוכחות של נוגדנים לאנטיגנים תאיים, הקיימים כתוצאה מטיהור לא מספק של חלבונים ויראליים. זיהוי נוגדנים בסרה של חולים לאנטיגנים ויראליים פנימיים וחיצוניים מאפשר לקבוע את שלב המחלה, ובניתוח אוכלוסיות, את השונות של חלבונים ויראליים. אימונובלוטינג לזיהום ב-HIV משמש כבדיקת אישור לזיהוי אנטיגנים ויראליים בודדים ונוגדנים אליהם. בעת ניתוח אוכלוסיות, השיטה משמשת לקביעת השונות של חלבונים ויראליים. הערך הרב של השיטה טמון באפשרות לנתח אנטיגנים המסונתזים באמצעות טכנולוגיית DNA רקומביננטי, ביסוס גודלם ונוכחותם של דטרמיננטים אנטיגנים.