ביצוע ניתוח PCR (אבחון PCR) מתחיל באיסוף חומר לבדיקה אצל גינקולוג, אורולוג או רופא עור. האיכות והאמינות של התוצאות שהושגו לאחר מכן מובטחות על ידי הכישורים הגבוהים ביותר והניסיון הרב של הרופאים של המרכז הרפואי Euromedprestige, העומדים בכל הכללים הדרושים PCR-ניתוח: סטריליות מלאה, שימוש בחומרים חד פעמיים בלבד.

החומר שנאסף מהמברשת מונח במיכל עם תמיסת מלח. לאחר הדגימה, יש להעביר את הדגימות למעבדת PCR בהקדם האפשרי.

ניתוח PCR במעבדה מתבצע בשלושה שלבים:

1. בידוד DNA
2. הגברה של שברי DNA
3. איתור מוצרי הגברה של DNA

מיצוי DNA הוא השלב הראשוני של אבחון PCR, אשר מהותו היא כדלקמן: הרופא לוקח את החומר למחקר מהמטופל ומעביר אותו לעיבוד מיוחד. במהלך העיבוד, הסליל הכפול של ה-DNA מפוצל לגדילים נפרדים. לחומר המטופל מוסיפים נוזל מיוחד הממיס חומרים אורגניים המפריעים ל"טוהר" התגובה. זה מסיר שומנים, חומצות אמינו, פפטידים, פחמימות, חלבונים ופוליסכרידים. התוצאה היא DNA או RNA.

העיקרון של שיטת PCR הוא "בניית" זיהומי DNA או RNA חדשים. לא ניתן לעשות זאת ללא הסרה של חומר סלולרי.

משך הזמן המושקע בחילוץ DNA תלוי בגורם הגורם לזיהום ובסוג החומר המשמש לבדיקת PCR. לדוגמה, זה לוקח 1.5-2 שעות להכין דם לשלב הבא.

0Array ( => ניתוח) מערך ( => 2) מערך ( =>.html) 2

הגברה של DNA

כדי לבצע את השלב הבא של אבחון ה-DNA - הגברה של DNA - הרופאים משתמשים במטריצות הנקראות DNA - מולקולות DNA של זיהומים, שעליהן יתבצע לאחר מכן "שיבוט" של DNA. כבר הוזכר שאין צורך בנוכחות ה-DNA השלם של הזיהום; לשלב זה מספיקה חתיכה קטנה ממולקולת ה-DNA, הייחודית לחיידק הזה (זיהום).

בלב הגברה של ה-DNA ובהתאם, בלב כל העיקרון של תגובת ה-PCR עומד התהליך הטבעי של השלמת ה-DNA לכל היצורים החיים – שכפול ה-DNA, המתבצע באמצעות הכפלת שרשרת DNA בודדת.

החל משבר בודד של DNA, רופא המעבדה מעתיק אותו ומגדיל את מספר העותקים בתגובת שרשרת: אחרי המחזור הראשון יש לך כבר 2 שברים, אחרי המחזור השני - 4, אחרי השלישי - 8, אחרי הרביעי. - 16, ואז 32, 64, 128, 256... עם כל מחזור, מספר העותקים מכפיל את עצמו, ולאחר עשרים מחזורים, הספירה נכנסת למיליונים, ואחרי שלושים, למיליארדים. המחזור נמשך מספר דקות ומצטמצם לשינוי מסוים במשטר הטמפרטורה בכור כימי קטן מאוד. כאן, בתמיסה בכמות מספקת, יש את כל המרכיבים הדרושים לסינתזה, קודם כל, נוקלאוטידים A, G, T ו-C, וגם בוצעו פעולות כימיות הכנה עדינות כך שמיד נוצר העתק מדויק מ כל קטע DNA מוגמר, ואז מהעותק הזה - שוב עותק, זו תגובת השרשרת המסועפת.

על ידי הצמדת פריימרים לשרשרת ה-DNA - "חתיכות" DNA (זוגות נוקלאוטידים) מסונתזים באופן מלאכותי בדומה ל-DNA של חיידקים (זיהום) - שניים קצרים, המורכבים משתי שרשראות של קטעי DNA, נוצרים סלילים, הנחוצים לסינתזה. של DNA עתידי.

סינתזה של שרשרת חדשה מתרחשת על ידי השלמת כל אחד משני גדילי ה-DNA. תהליך ההגברה מתרחש בעזרת אתר ספציפי - DNA פולימראז, שהעניק את השם לשיטת המעבדה. הפולימראז פועל כזרז לתגובה ומנטר את ההתקשרות הרציפה של בסיסי נוקלאוטידים לגדיל ה-DNA החדש שגדל.

לפיכך, הגברה של DNA היא עלייה מרובה במספר העותקים של DNA שהם ספציפיים, כלומר, הטבועים רק באורגניזם מסוים. אין צורך להשלים את כל שרשרת ה-DNA על מנת לראות את הגורם הגורם לזיהום. יש צורך רק באזור האופייני לחיידק זה כפרט.

5360 לשפשף. עלות תכנית מקיפה עם גסטרואנטרולוג

25% הנחה בקבלה של קרדיולוג

- 25%יְסוֹדִי
ביקור רופא
מטפל סוף שבוע

5 160 לשפשף. במקום 5,420 רובל. בדיקת גברים לזיהומים אורולוגיים

אלרגולוגיה 5 120 לשפשף. במקום 5,590 רובל.

כל שלבי ההגברה החוזרים על עצמם מתרחשים בטמפרטורות שונות. לניתוח PCR, נעשה שימוש בציוד הניתן לתכנות במיוחד - PCR - תרמוסטט או מגבר, אשר משנה טמפרטורות באופן אוטומטי. ההגברה מתבצעת על פי תוכנית קבועה מראש המתאימה לסוג הזיהום המתגלה. בהתאם לתוכנית ולסוג הזיהום המתגלה, תהליך ה-PCR האוטומטי נמשך בין שעתיים לשלוש שעות.

תפקיד חשוב באבחון PCR ממלא בהסמכתו של עוזר המעבדה המבצע את הניתוח, ההגדרה הנכונה של ציוד ה-PCR ופרשנות התוצאות תלויות בו. לרופאי המרכז הרפואי Euromedprestige יש ניסיון רב בביצוע אבחון DNA, המבטיח את מהימנות תוצאות המחקר ומבטיח הצלחה חיובית בטיפול. מחלות מדבקות. לבצע בדיקות PCR ולערוך אבחון מלאוטיפול במחלות זיהומיות אצלנו מרכז רפואייורומדיוקרה.

במהלך זיהוי תוצרי הגברה, התערובת המתקבלת של תוצרי הגברה מופרדת. לתערובת מוסיפים תמיסות מיוחדות המעניקות לשברי DNA יכולת פלואורסצציה - משקפים פסים זוהרים כתומים-אדומים. הזוהר המתקבל מעיד על נוכחות DNA של וירוסים, חיידקים או חיידקים בחומר שנלקח מהמטופל לצורך ניתוח PCR.

SEI HPE "האקדמיה הרפואית הממלכתית של קרסנויארסק

על שם הסוכנות הפדרלית לבריאות וחברתית יאסנצקי »

המחלקה לגנטיקה רפואית ונוירופיזיולוגיה קלינית, הנפקה

עקרונות עיקריים של השיטה

תגובת שרשרת פולימראז

אַרְגַז כֵּלִיםלתלמידי 3-4 קורסים

בהתמחויות הרפואה הכללית (060101) ו

קרסנויארסק - 2007

שניידר, N. A., Butyanov, R. A. עקרונות בסיסיים של שיטת תגובת שרשרת הפולימראז. מדריך מתודולוגי לעבודה חוץ כיתתית של תלמידי 3-4 קורסים בהתמחויות רפואה כללית (060101) ורפואת ילדים (060103). - Krasnoyarsk: בית ההוצאה לאור של GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42p.

המדריך המתודולוגי תואם באופן מלא לדרישות תקן המדינה (2000) ומשקף את ההיבטים העיקריים שיטה מודרניתאבחון מחלות תורשתיותאנושי - שיטת תגובת שרשרת הפולימראז, החומר הלימודי מותאם אליה טכנולוגיות חינוכיותתוך התחשבות במפרט ההכשרה ב-3-4 קורסים של פקולטות רפואיות וילדים.

סוקרים:ראש המחלקה לגנטיקה רפואית, המוסד החינוכי הממלכתי להשכלה מקצועית גבוהה

"האוניברסיטה הרפואית הממלכתית של נובוסיבירסק של הסוכנות הפדרלית לבריאות ו התפתחות חברתית”, דוקטור למדעי הרפואה, פרופסור;

שכפול הדנ"א

מושא המחקר של שיטה זו הוא חומצה Deoxyribonucleic (DNA). DNA הוא נושא אוניברסלי של מידע גנטי בכל האורגניזמים הקיימים על פני כדור הארץ (למעט מיקרואורגניזמים המכילים RNA). DNA הוא גדיל כפול המעוות לתוך סליל. כל גדיל מורכב מנוקלאוטידים המחוברים בסדרה. לגדילי DNA יש את הכיוון ההפוך: קצה 5' של גדיל אחד מתאים לקצה 3' של הגדיל השני. נכס ייחודי DNA הוא היכולת שלו לשכפל את עצמו. תהליך זה נקרא שכפול. שכפול של מולקולת ה-DNA מתרחש במהלך התקופה הסינתטית של האינטרפאזה. כל אחת משתי השרשראות של מולקולת ה"אב" משמשת תבנית ל"בת". לאחר השכפול, מולקולת ה-DNA החדש שסונתזה מכילה גדיל "אימהי" אחד, והשני - "בת", מסונתזת לאחרונה (שיטה שמרנית למחצה). ל סינתזת מטריצהעבור מולקולת DNA חדשה, המולקולה הישנה צריכה להיות מנוזלת ומתיחה. שכפול מתחיל במספר מיקומים במולקולת ה-DNA. הקטע של מולקולת DNA מתחילת שכפול אחד לתחילתו של אחר נקרא רפליקון.

תחילת השכפול מופעלת פריימרים(זרעים), המורכב מ-100-200 זוגות בסיסים. האנזים DNA helicase מתפרק ומפריד את סליל ה-DNA האב לשני גדילים, שעליהם, על פי עקרון ההשלמה, בהשתתפות האנזים DNA פולימראז, מורכבים גדילי DNA "בת". על מנת שהאנזים יתחיל את עבודתו, נדרשת נוכחות של בלוק התחלתי - שבר דו-גדילי ראשוני קטן. הבלוק ההתחלתי נוצר כאשר הפריימר יוצר אינטראקציה עם האזור המשלים של הגדיל המקביל של ה-DNA האב. בכל רפליקון, DNA פולימראז יכול לנוע לאורך גדיל "האם" בכיוון אחד בלבד (5`=>3`).

על הגדיל המוביל, כשהרפליקון מתפרק, גדיל "בת" גדל בהדרגה ברציפות. על הגדיל המשכי, גם גדיל הבת מסנתז בכיוון (5`=>3`), אך בשברים נפרדים כשהרפליקון מתפרק.

לפיכך, ההתקשרות של נוקלאוטידים משלימים של גדילי "הבת" הולכת בכיוונים מנוגדים (אנטי מקביל). שכפול בכל העתקים מתרחש בו זמנית. שברים וחלקים של גדילי "בת" המסונתזים בהעתקים שונים מקושרים לגדיל בודד על ידי אנזים ליגאז. שכפול מאופיין בשימור למחצה, אנטי-מקביליות וחוסר המשכיות. כל הגנום של התא משוכפל פעם אחת לתקופת זמן המקבילה למחזור מיטוטי אחד. כתוצאה מתהליך השכפול נוצרות שתי מולקולות DNA ממולקולת DNA אחת, שבה גדיל אחד הוא ממולקולת ה-DNA האב, והשני, הבת, מסונתז לאחרונה (איור 1).

אורז. 1. תרשים של שכפול מולקולת DNA.

לפיכך, מחזור שכפול ה-DNA כולל שלושה שלבים עיקריים:

1. התנתקות של סליל ה-DNA והתפצלות של גדילים (דנטורציה);

2. הצמדת פריימרים;

3. השלמת השרשרת של חוט הילד.

עקרון שיטת PCR

שכפול DNA הוא שיצר את הבסיס ל-PCR. ב-PCR, התהליכים המפורטים לעיל מתבצעים במבחנה במצב מחזורי. המעבר משלב אחד של התגובה למשנהו מושג על ידי שינוי הטמפרטורה של תערובת הדגירה. כאשר התמיסה מחוממת ל-93-95 מעלות צלזיוס, מתרחשת דנטורציה של DNA. כדי להמשיך לשלב הבא - הוספה או "חישול" של פריימרים - תערובת הדגירה מקוררת ל-50-65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התערובת מחוממת ל-70-72 מעלות צלזיוס - הפעולה האופטימלית של taq-DNA פולימראז - בשלב זה, הושלם גדיל DNA חדש. ואז המחזור חוזר שוב. במילים אחרות שיטת PCR היא עלייה מרובה במספר העותקים (הַגבָּרָה) קטע ספציפי של DNA המזרז על ידי האנזים DNA פולימראז.

ההארכה של גדילי ה-DNA הבת חייבת להתרחש בו-זמנית על שני הגדילים של ה-DNA האימהי, ולכן שכפול של הגדיל השני דורש גם פריימר משלו. לפיכך, שני פריימרים מוכנסים לתערובת התגובה: האחד לשרשרת "+" והשני לשרשרת "-". לאחר שהצטרפו לגדילים ההפוכים של מולקולת ה-DNA, הפריימרים מגבילים את עצמם לאותו חלק שלה, שלאחר מכן יוכפל או יוגבר שוב ושוב. אורכו של מקטע כזה, הנקרא אמפליקון, הוא בדרך כלל כמה מאות נוקלאוטידים.

שלבי PCR

כל מחזור הגברה כולל 3 שלבים המתרחשים בתנאי טמפרטורה שונים (איור 2).

· שלב 1:דנטורציה של DNA . הוא זורם ב-93-95° למשך 30-40 שניות.

· שלב 2:חישול פריימר . הצמדת פריימר מתרחשת משלימה לרצפים המתאימים על גדילי DNA מנוגדים בגבולות של אזור ספציפי. לכל זוג פריימרים יש טמפרטורת חישול משלו, שערכיה הם בטווח של 50-65 מעלות צלזיוס. זמן חישול 20-60 שניות.

· שלב 3:הארכה של שרשראות דנ"א. הארכה משלימה של שרשראות DNA מתרחשת מקצה 5" לקצה 3" של השרשרת בכיוונים מנוגדים, החל מאתרי ההצמדה של הפריימר. החומר לסינתזה של גדילי DNA חדשים הם טריפוספטים מסוג deoxyribonucleoside שנוספו לתמיסה. תהליך הסינתזה מזורז על ידי האנזים taq-polymerase ומתרחש בטמפרטורה של 70-72 מעלות צלזיוס. זמן סינתזה - 20-40 שניות.

גדילי ה-DNA החדשים שנוצרו במחזור ההגברה הראשון משמשים כתבניות למחזור ההגברה השני, בו נוצר שבר DNA ספציפי של אמפליקון (איור 3). במחזורי ההגברה הבאים, האמפליקונים משמשים כתבנית לסינתזה של שרשראות חדשות.

לפיכך, ישנה הצטברות של אמפליקונים בתמיסה לפי הנוסחה 2", כאשר n הוא מספר מחזורי ההגברה. לכן, גם אם רק מולקולת DNA דו-גדילית אחת הייתה בתחילה בתמיסה הראשונית, אז כ-108 מולקולות אמפליקון. מצטברים בתמיסה ב-30-40 מחזורים. הכמות הזו מספיקה לזיהוי ויזואלי אמין של שבר זה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל agarose.

תהליך ההגברה מתבצע בתרמוסטט מיוחד הניתן לתכנות ( רוכב אופניים), שלפי תוכנית נתונה משנה טמפרטורות אוטומטית בהתאם למספר מחזורי ההגברה.

הרכיבים הבאים נדרשים להגברה:

· תבנית DNA(DNA או חלק ממנו המכיל את הפרגמנט הספציפי הרצוי);

· פריימרים(אוליגונוקלאוטידים סינתטיים (20-30 זוגות נוקלאוטידים) משלימים לרצפי DNA בגבולות הפרגמנט הספציפי הנקבע). הבחירה של מקטע מסוים ובחירת הפריימרים ממלאים תפקיד מרכזי בספציפיות של ההגברה, המשפיעה על איכות הניתוח.

· תערובת של דיאוקסינוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs)(תערובת של ארבעה dNTPs, שהם החומר לסינתזה של גדילי DNA משלימים חדשים בריכוזים שווים של 200-500 מיקרון)

· אֶנזִיםטאק-פולימראז(פולימראז DNA יציב תרמי, המזרז את הארכת שרשראות הפריימר על ידי הוספה רציפה של בסיסי נוקלאוטידים לשרשרת הגדלה של DNA מסונתז, 2-3 מ"מ).

· פתרון חיץ(מדיום תגובה המכיל יוני Mg2+ הנחוצים לשמירה על פעילות האנזים, PH 6.8-7.8).

כדי לקבוע אזורים ספציפיים בגנום של נגיפי RNA, עותק DNA מתקבל תחילה מתבנית RNA באמצעות תגובת שעתוק הפוכה (RT) המזוזת על ידי האנזים הפוך טרנסקריפטאז (Reverse transcriptase).

אורז. 2. הגברה (מחזור ראשון).

אורז. 3. הגברה (מחזור שני).

יישומים עיקריים של PCR

תרופה קלינית:

o אבחון של זיהומים,

o זיהוי מוטציות, כולל אבחון מחלות תורשתיות,

o גנוטיפ, כולל גנוטיפ HLA,

o טכנולוגיות סלולריות

אקולוגיה (כדרך לנטר את המצב והאיכות של חפצים סביבתיים ומזון)

הגדרה של אורגניזמים מהונדסים (GMO)

זיהוי אישי, אבהות, זיהוי פלילי

ביולוגיה כללית ופרטנית,

עקרונות בסיסיים

ארגון מעבדות אבחון

העבודה במעבדת ה-PCR מתבצעת בהתאם ל"כללים לתכנון, בטיחות, תברואה תעשייתית, משטר אנטי-מגיפי והיגיינה אישית בעבודה במעבדות (מחלקות, מחלקות) של מוסדות סניטריים ואפידמיולוגיים של מערכת הבריאות.

זיהום דגימות DNA

ביצוע אבחון PCR קשור לבעיה הנגרמת מהרגישות הגבוהה של השיטה – האפשרות נְגִיעוּת. אם כמויות עקבות של DNA חיובי נכנסות לצינור התגובה (מוצרי הגברה ספציפיים של DNA - אמפליקונים; תקן DNA משמש כבקרה חיובית; DNA חיובי של דגימה קלינית) מוביל להגברה של שבר DNA ספציפי במהלך PCR, וכתוצאה מכך, הופעת תוצאות חיוביות כוזבות.

במהלך העבודה, אולי תפגשו שני סוגי זיהום:

1. זיהום צולבמדגימה לדגימה (במהלך עיבוד דגימות קליניות או בעת חפירת תערובת התגובה), מה שמוביל להופעת תוצאות חיוביות שגויות ספוראדיות;

2. זיהום מוצר הגברה(אמפליקונים) שיש הערך הגבוה ביותר, כי במהלך תהליך ה-PCR, אמפליקונים מצטברים בכמויות אדירות והם מוצרים אידיאליים להגברה מחדש.

עקבות זיהום אמפליקון של כלים, פיפטות אוטומטיות וציוד מעבדה, פני השטח של טבלאות מעבדה, או אפילו פני העור של עובדי המעבדה מובילים להופעת תוצאות חיוביות כוזבות שיטתיות. קביעת מקור הזיהום יכולה להיות קשה מאוד ודורשת השקעה משמעותית של זמן וכסף. הניסיון שנצבר עד היום בעבודת מעבדות בשיטת PCR לאבחון מאפשר לנו לגבש את הדרישות הבסיסיות לארגון מעבדות כאלו ולביצוע הניתוחים עצמם. עמידה בדרישות אלו מבטלת את האפשרות של זיהום וקבלת תוצאות חיוביות כוזבות.

שלבי ניתוח PCR

מופרדים גיאוגרפית, הצבתם בחדרים נפרדים (איור 4.5):

· חדר טרום PCR,שבו מתבצע עיבוד של דגימות קליניות, מיצוי DNA, הכנת תערובת התגובה ל-PCR ו-PCR (אם קיימים תנאים, מומלץ גם לבצע את שני השלבים האחרונים בחדר נפרד נוסף). בחדרים אלו אסור לבצע את כל שאר סוגי העבודה עם הסוכנים הנלמדים, אשר אבחון ה-PCR שלהם מתבצע במעבדה זו.

· חדר לאחר PCR,שבו מתבצע זיהוי של מוצרי הגברה. ניתן להשתמש בשיטות זיהוי אחרות בחדר זה. רצוי למקם את החדר לגילוי תוצרי הגברה רחוק ככל האפשר מחדרי הקדם-PCR.

חדרי עבודה מצוידים במנורות אולטרה סגול עם קרינה מרבית באזור 260 ננומטר (סוג DB-60) בקצב של 2.5 ואט ל-1 מ"ק. המנורות ממוקמות כך שמשטחי שולחנות העבודה, הציוד והחומרים איתם בא המפעיל במגע במהלך ניתוח ה-PCR חשופים לקרינה ישירה. ההקרנה מתבצעת תוך שעה אחת לפני תחילת העבודה ותוך שעה לאחר סיום העבודה.

רופאי מעבדה עובדים בבגדי מעבדה מיוחדים, המוחלפים במעבר מחדר אחד למשנהו, ובכפפות חד פעמיות. עיבוד בגדים מחדרים שונים מתבצע בנפרד. עובדים שונים עובדים בשלבים שונים של ניתוח ה-PCR.

לעבודה, נעשה שימוש בסטים נפרדים של מכשירי פלסטיק, כלי זכוכית, ציוד מעבדה, חלוקים וכפפות, המיועדים לשלבי ניתוח שונים ואינם ניידים מחדר אחד למשנהו. ציוד, חומרים ומלאי בכל חדר מסומנים בהתאם.

כל שלבי העבודה מתבצעים רק עם שימוש בחומרים מתכלים חד-פעמיים: טיפים לפיפטות אוטומטיות, מבחנות, כפפות וכדומה. הקפידו לשנות את הטיפים בעת מעבר מדגימה לדגימה. יש צורך להשתמש בקצות עם מסנן מחסום אירוסול כדי למנוע מיקרוטיפות של התמיסה להיכנס לפיפטה. צינורות וטיפים משומשים מושלכים במיכלים מיוחדים או במיכלים המכילים תמיסת חיטוי. דגימות קליניות מאוחסנות בנפרד מגיבים.

לעיבוד וניקיון מקום העבודה, בכל חדר יש ספוגיות גזה (מפיות), פינצטה, תמיסות חיטוי והשבתה.

במעבדת האבחון PCR לא נכללת עבודה הקשורה לייצור (שיבוט) ובידוד של פלסמידים רקומביננטיים המכילים רצפי DNA או שברי גנים של פתוגנים המאובחנים במעבדה זו.

איסוף חומר קליני

החומר הנלמד ל-PCR יכול להיות גרידה של תאי אפיתל, דם, פלזמה, סרום, נוזל פלאורלי ומוחי, שתן, כיח, ריר והפרשות ביולוגיות אחרות, דגימות ביופסיה.

הדגימה של החומר מתבצעת בתנאי חדר הטיפולים של הפרופיל המתאים. לאחר הדגימה, יש לקחת את הדגימות למעבדת האבחון PCR בהקדם האפשרי.

הדגימה חייבת להתבצע באמצעות מכשירים סטריליים, רצוי חד פעמיים, רק בשפופרות פלסטיק סטריליות חד פעמיות או צינורות זכוכית, מטופלים מראש במשך שעה בתערובת כרום, שטפו היטב במים מזוקקים וסולחנו בתנור בטמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס. במשך שעה 1.

אזור גילוי (קומה אחרת או בניין אחר).

אורז. 4. מכשיר מעבדת PCR עם זיהוי באמצעות אלקטרופורזה.

אזור זיהוי (קומה או בניין שונים)

אורז. 5. מכשיר מעבדה PCR עם זיהוי פלורסנט (ניתוח כמותי).

אורז. 6. חדר חילוץ DNA.מוצגת קופסת שולחן עם מנורה קוטל חיידקים.

אורז. 7. חדר הגברה.

אורז. 8. חדר איתור.

אורז. 9. דגימות דם לאבחון DNA של מחלות תורשתיות.

אחסון והובלה של דוגמאות

לאבחון של מחלות תורשתיות, דגימות דם מאוחסנות על גבי טפסי נייר מיוחדים או באפינדורפים (מבחנות פלסטיק) במצב קפוא לאורך זמן (איור 9).

לאבחון של מחלות זיהומיות, דגימות נשמרות בטמפרטורת החדר למשך לא יותר משעתיים. אם נדרש אחסון ארוך יותר, ניתן להכניס את הדגימות למקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לתקופה שלא תעלה על 24 שעות. אחסון ארוך יותר (עד שבועיים) מקובל בהקפאה במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. אסור להקפיא-הפשרה חוזרת של דגימות.

אם מעבדת האבחון PCR וחדר ההליכים לדגימה מופרדים טריטוריאלית, אזי יש להעביר את הדגימות בתרמוסים או במיכלים תרמיים בהתאם לכללי אחסון הדגימות ולכללי הובלת חומרים מדבקים.

מיצוי DNA מדגימות

השיטה של ​​ספיגה מוצק, המורכבת מהוספת חומר ליזינג המכיל תמיסה של גואנידין, ספיגה של DNA על סורבנט, שטיפה חוזרת וספיגת DNA עם תמיסת חיץ, הפכה לנפוצה. במקרה של עיבוד סרום, פלזמה או דם מלא, משתמשים בדרך כלל בשיטת המיצוי הפנולי. השיטה כוללת דה-פרוטאין עם פנול/כלורופורם ואחריו משקעים של DNA (או RNA) עם אתנול או איזופרופנול. העיבוד מתבצע במבחנות מיקרוצנטריפוגות מסוג Eppendor P בנפח 1.5 מ"ל. זמן העיבוד הוא 1.5-2 שעות (איור 10).

אורז. 10. בידוד של DNA.

ביצוע PCR

כמות מסוימת של הדגימה מהדגימה הקלינית המעובדת מועברת לשפופרת מיקרוצנטריפוגה מיוחדת מסוג אפנדורף בנפח של 0.2 או 0.5 מ"ל. תערובת הגברה המורכבת ממים, חוצץ PCR, תמיסת dNTP, תמיסת פריימר ותמיסה מתווספת ל- אותו צינור.Taq-polymerase (הוסף אחרון לתערובת) בדרך כלל, נפח תערובת התגובה הוא 25 µl לאחר מכן מוסיפים טיפה אחת של שמן מינרלי לכל צינור כדי למנוע אידוי של תערובת התגובה במהלך ההגברה הצינורות מועברים אל תרמוסטט ניתן לתכנות (מגבר), שבו ההגברה מתבצעת במצב אוטומטי לפי תוכנית נתונה (איור 11).

אורז. אחד עשר. מגבר" טרמוסייקלר ».

זמן התגובה, בהתאם לתוכנית הנתונה, הוא 2-3 שעות. במקביל לדגימות הניסוי ממוקמות דגימות בקרה: הבקרה החיובית כוללת את כל מרכיבי התגובה, אך במקום החומר של הדגימה הקלינית, מוכנסת הכנת DNA בקרה של הגן הנחקר. הבקרה השלילית כוללת את כל מרכיבי התגובה, אך במקום החומר הקליני או תכשיר ה-DNA, מוסיפים כמות מתאימה של מים מופחתים או תמצית שאינה מכילה את ה-DNA הנחקר. יש צורך בבקרה שלילית כדי לבדוק את מרכיבי התגובה על היעדר DNA בהם עקב זיהום וכדי לשלול תוצאות חיוביות כוזבות.

רישום תוצאות

קטע ה-DNA הספציפי המוגבר מזוהה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בנוכחות אתידיום ברומיד. אתידיום ברומיד יוצר תרכובת אינטרסטיציאלית יציבה עם שברי DNA, המופיעה כרצועות זוהרות כאשר הג'ל מוקרן בקרינת UV באורך גל של 290-330 ננומטר. בהתאם לגודל האמפליקונים של PCR המתקבלים, נעשה שימוש בג'ל המכיל 1.5% עד 2.5% agarose. להכנת ג'ל אגרוז ממיסים תערובת של אגרוז, חוצץ ומים במיקרוגל או באמבט מים ומוסיפים תמיסה של אתידיום ברומיד. מקוררים ל-50-60 מעלות צלזיוס, יוצקים את התערובת לתבנית בשכבה בעובי 4-6 מ"מ ובעזרת מסרקים מיוחדים יוצרים כיסים בג'ל למריחת הדוגמא. המסרקים מוגדרים כך שבין תחתית הבארות לבסיס הג'ל נשארת שכבת אגרוז 0.5-1 מ"מ. לאחר שהג'ל התמצק, מורחים על הכיסים הגברה בכמות של 5-15 μl. מומלץ לבצע אלקטרופורזה של תערובת של סמני אורך שברי DNA במקביל לדגימות בקרה וניסויים. בדרך כלל, תערובת כזו מכילה עשרה שברי DNA 100, 200, 300 וכו' זוגות בסיסים ארוכים.

הגדרת דגימה כזו מאפשרת לאמת את אורך האמפליקונים בדגימות הבקרה והניסוי. הג'ל עם המדגם המיושם מועבר לתא אלקטרופורזה מלא במאגר, החדר מחובר למקור חשמל וההפרדה האלקטרופורטית של מוצרי ההגברה מתבצעת למשך 30-45 דקות בחוזק שדה חשמלי של 10-15 V/cm. במקרה זה, החלק הקדמי של הצבע, שהוא חלק מתערובת התגובה, חייב לעבור לפחות 3 ס"מ.

לאחר סיום האלקטרופורזה, הג'ל מועבר לזכוכית ה-transilluminator ונצפה באור אולטרה סגול. לתיעוד הג'ל מצולם על סרט מיקרת 300 או מוקלט באמצעות מערכת וידאו המחוברת למחשב.

דגימות הבקרה מוערכות תחילה. בנתיב האלקטרופורטי המתאים לבקרה החיובית, צריכה להיות רצועה זוהרת כתומה. הניידות האלקטרופורטית שלו צריכה להתאים לאורך האמפליקון המצוין בהוראות.

במסלול האלקטרופורטי המקביל לבקרה השלילית, פס כזה צריך להיעדר. נוכחות של פס כזה בבקרה השלילית מעידה על זיהום - זיהום של הריאגנטים המשמשים עם ה-DNA או האמפליקון שנחקרו. דגימות הבדיקה מוערכות על ידי נוכחות בנתיב המתאים של רצועה הממוקמת באותה רמה כמו הרצועה בדגימת הביקורת החיובית. עוצמת זוהר הרצועה תואמת את כמות ה-DNA הנבדקת בדגימה, מה שמאפשר הערכה חצי כמותית של PCR. בדרך כלל תוצאות חיוביות מוערכות בסולם של ארבע נקודות. אם זוהר הלהקה במדגם הניסוי חלש מאוד, יש לארגן מחדש דגימה כזו (איור 12).

אורז. 12. אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.

יישומי PCR עבוראבחון של מוטציות נקודתיות ופולימורפיזם של גנים

אחד מתחומי היישום המובילים של PCR בטיפול רפואי מעשי הוא אבחון של מוטציות נקודתיות ופולימורפיזם של גנים. . ישנן שיטות ישירות ועקיפות לאבחון DNA. באותם מצבים בהם ידוע על גן, שנזקיו מביאים להתפתחות מחלה תורשתית, ניתן לאתר נזק זה בשיטות גנטיות מולקולריות. שיטות כאלה נקראות ישירות. באמצעות שיטות ישירות, מתגלות הפרעות ברצף הנוקלאוטידים הראשוני של ה-DNA (מוטציות וסוגיהם). שיטות ישירות מאופיינות בדיוק המגיע לכמעט 100%.

עם זאת, בפועל, ניתן ליישם שיטות אלו בתנאים מסוימים.:

עם לוקליזציה ציטוגנטית ידועה של הגן האחראי להתפתחות מחלה תורשתית;

יש לשבט את גן המחלה ולדעת את רצף הנוקלאוטידים שלו.

המטרה של אבחון DNA ישיר היא לזהות אללים מוטנטיים.

לפיכך, באותם מצבים בהם ידוע איזה סוג של פגיעה ב-DNA מוביל למחלה תורשתית, בודקים ישירות את קטע ה-DNA המכיל את הנזק, כלומר, נעשה שימוש בשיטה הישירה של אבחון DNA.

עם זאת, עד כה, הגנים של מחלות רבות לא מופו, ארגון האקסון-אינטררון שלהם אינו ידוע, ורבים מחלות תורשתיותמאופיין בהטרוגניות גנטית מובהקת, שאינה מאפשרת שימוש מלא בשיטות ישירות לאבחון DNA. לכן, במקרים בהם לוקליזציה של הנזק אינו ידוע, משתמשים בגישה שונה הקשורה לחקר הסביבה של הגן האחראי למחלת הגן, בשילוב עם ניתוח משפחתי, כלומר שיטות עקיפות לאבחון גנטי מולקולרי. של מחלות תורשתיות משמשים.

ניתן להשתמש כדי לזהות מוטציות נקודתיות ומחיקות קטנות דרכים שונותעם זאת, כולם מבוססים על השימוש בשיטת PCR. תגובה זו מאפשרת לך להכפיל שוב ושוב את רצף הנוקלאוטידים של ה-DNA, ולאחר מכן לחפש מוטציות. שיטות לחיפוש אחר שברי DNA הנושאים מוטציות מבוססות על ניתוח השוואתירצפי נוקלאוטידים של DNA מוטנטיים ונורמליים.

ניתוח מוצרי PCR

בתהליך של אבחון DNA ישיר

זה כרוך במחקר של תכונות ספציפיות של האזור המוגבר של הגן. לפיכך, במחלות הנגרמות כתוצאה מהתרחבות חוזרות של טרינוקלאוטידים, תוצרי ההגברה שונים באורכם (המשקפים מספר שונה של שלישיות באזור הגן הנחקר) וכתוצאה מכך, במהירות התנועה שלהם בג'ל. בשל כך, מושגת הפרדה אלקטרופורטית ברורה של אללים נורמליים ומוטנטים וקביעה מדויקת של המקטע המוארך מבחינה פתולוגית, כלומר אבחון DNA של המחלה (איור 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

אורז. 14. אבחון של מחיקה בְּדִיחָה בגן DYT 1 בחולים עם דיסטוניה בלתי תלויה בדופא (אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד). מסלולים 2,3,6 - חולה; נתיבים 1,4,5 - בקרה. החץ הדק מציין את האלל הנורמלי, החץ המודגש מציין את האלל הקצר המוטנטי (מחיקה של שלושה נוקלאוטידים).

אם אזור ה-DNA הנחקר נכלל כולו במחיקה מורחבת, אזי הגברה PCR של DNA מהאלל שנמחק זה לא יתבצע עקב היעדר מקומות להכלאה של פריימר. במקרה זה, תאובחן מחיקה הומוזיגוטית על סמך היעדר מוחלט של תוצר ה-PCR של התגובה (סינתזת DNA בלתי אפשרית משני העותקים של הגן). עם מחיקה הטרוזיגטית, ניתן לזהות תוצר PCR המסונתז מאלל תקין (בטוח), אולם לאבחון אמין של מוטציה כזו, יש צורך להשתמש בשיטות הדמיית DNA מתוחכמות יותר המאפשרות להעריך את המינון של המינון הסופי. מוצר PCR.

כדי לזהות מוטציות נקודתיות (לרוב החלפות נוקלאוטידים) באתרים מסוימים, נעשה שימוש בשיטת PCR בשילוב עם שיטות אחרות של ניתוח גנטי מולקולרי. אם המיקום והטבע של המוטציה הנקודתית המוצעת ידועים במדויק, אז לצורך זיהוי מכוון של מוטציה כזו, אנדונוקליזות הגבלה (מגבלות) הם אנזימים תאיים מיוחדים המבודדים מזנים שונים של חיידקים.

אנזימים אלו מזהים רצפי נוקלאוטידים ספציפיים באורך של בין ארבעה לעשרה נוקלאוטידים. לאחר מכן הם מבצעים הגבלה (lat. (חיתוך) של הרצפים הללו כחלק ממולקולת DNA דו-גדילית. כל אנזים הגבלה מזהה וחותך במקום קבוע רצף נוקלאוטידים מוגדר בקפדנות - אתר הגבלה (אתר זיהוי).

במקרים בהם מוטציה נקודתית משנה את אתר הזיהוי הטבעי של אנזים הגבלה מסוים, אנזים זה לא יוכל לבקע את המקטע המוגבר ב-PCR המוגבר. במקרים מסוימים, המוטציה מובילה להופעת אתר זיהוי חדש של אנזים הגבלה מסוים, אשר נעדר בנורמה.

בשני המצבים, תוצרי ה-PCR המוטנטים והנורמליים המטופלים באנזים ההגבלה הנבחר יתנו שברי הגבלה באורכים שונים, אותם ניתן לזהות בקלות באמצעות אלקטרופורזה (איור 15).

לפיכך, אם יש צורך לזהות במהירות כל מוטציה נקודתית מסוימת, המשימה מצטמצמת לחיפוש אחר אנזים ההגבלה המתאים, שאתר הזיהוי שלו ממוקם במקום של רצף הנוקלאוטידים המופרע. טיפול במוצרי PCR עם אנזים הגבלה זה יאפשר הבחנה קלה של אללים נורמליים ומוטנטים. ניתוח הגבלה מפשט מאוד את הזיהוי של מוטציות נקודתיות ידועות ונמצא כיום בשימוש נרחב לאבחון DNA ישיר של מחלות תורשתיות.

שלב סופי ניתוח גנטי מולקולרי של מוטציותהוא קביעת רצף הנוקלאוטידים של קטע ה-DNA הנחקר (רצף), אשר מושווה לנורמה ומנוסחת האבחנה הגנטית הסופית. הודות להתקדמות בגנטיקה מולקולרית, פותחו כיום שיטות אבחון DNA עבור יותר מ-400 מחלות תורשתיות.

אורז. 15. זיהוי של מוטציה נקודתית באמצעות ניתוח הגבלה: A - אזור ניתן להגברה של הגן המכיל אתר הגבלהAGCTעבור אנדונוקלאז הגבלהאלו אני. מוּטָצִיָהG→ אמשנה את רצף הנוקלאוטידים הזה, וכתוצאה מכך נוצר אנזים הגבלהאלואיחָסוּם; B - אלקטרופרוגרמה של מוצרי הגבלה: מסלול 1 - הומוזיגוזיות לאלל הנורמלי; מסלול 2, הומוזיגוזיות למוטציה; מסלול 3 - מצב הטרוזיגוטי (אלל תקין + מוטציה).

אבחון של מחלות תורשתיות המבוסס על בדיקה ישירה של אללים מוטנטים בחולים, בני משפחתם או נשאים הטרוזיגוטיים המשוערים של מוטציות פתולוגיות מתאים לאבחון טרום סימפטומטי וקדם לידתי, שניתן ליישם בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות העובר, לפני הופעת כל תסמין קליני או ביוכימי.מחלה.

ללא קשר לשיטת זיהוי המוטציות, אפיון מולקולרי מדויק של כל מוטציה יכול להתקבל רק על ידי רצף ישיר. כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי, בשנים האחרונות נעשה שימוש נרחב במכשירים מיוחדים - רצפים, המאפשרים לזרז משמעותית את תהליך קריאת מידע ה-DNA.

הדרך ליישום רחב יותר של מחקר ביולוגי מולקולרי במעבדות אבחון קליני נפתחת על ידי האצת התהליך האנליטי על ידי ביצוע כל ההליכים ברצף אחד, ללא העברת דגימה, יצירת תנאים למניעת זיהום במהלך בדיקות מקבילות של מספר אנליטים וברישום אובייקטיבי. של תוצאות בכל מחזור.

שינויים עיקריים בשיטת PCR

משמש לסריקה מהירה ולחיפוש אחר מוטציות גנים ידועות.

Multiplex (multiprimer) PCR

שיטה זו מבוססת על הגברה בו-זמנית של מספר אקסונים של הגן הנחקר בתגובה אחת. זה מאפשר בדיקה מהירה וחסכונית של המוטציות השכיחות ביותר. לדוגמה, כדי לאבחן במהירות את הובלת המחיקות בגן הדיסטרופין בחולים עם ניוון שרירים פרוגרסיבי של דושן/בקר, מתבצעת הגברה סימולטנית של סט האקסונים המשתנים בתדירות הגבוהה ביותר של גן זה. מאחר שמחלות אלו עוברות בתורשה מסוג רצסיבי מקושר X וקשורות לפגיעה בכרומוזום X היחיד אצל בנים, במקרה של מחיקה ממושכת, אלקטרופורזה של תוצרי התגובה תגלה את היעדר שברי DNA אחד או יותר (אקסונים). ), שיכול לשמש אישור מולקולרי לאבחנה. בנוסף, על ידי בחירת אזורי גנים ספציפיים להגברת PCR, מתאפשרת הערכה מדויקת למדי של האורך הכולל של המחיקה ונקודות השבירה של הגנים (עד האקסון).

השימוש המשולב במספר תגובות ריבוי מאפשר לאבחן עד 98% מכלל המחיקות המתרחשות בחולים עם ניוון שרירים פרוגרסיבי של דושן/בקר. זהו כ-60% מסך המוטציות המוכרות בגן הדיסטרופין ומצביע על יעילות גבוהה מאוד של שיטת סקר זו לאבחון DNA של דיסטרופינפתיה (איור 16).

אורז. 16. אבחון DNA ישיר של ניוון שרירים Duchenne באמצעות Multiplex PCR (אגרוז ג'ל אלקטרופורזה). בכל אחד מהפרטים שנבדקו, ארבעה אקסונים של הגן דיסטרופין הוגברו בו זמנית (אקסונים 17, 19, 44 ו-45; חיצים מציינים את תוצרי ההגברה המתאימים). נתיב 1 - ביקורת, נתיבים 2-5 - חולים עם ניוון שרירים דושן עם מחיקות שונות של הגן דיסטרופין (נתיבים 2 ו-5 - מחיקת אקסון 45, נתיב 3 - מחיקת אקסון 44, נתיב 4 - מחיקת אקסון 17 ו-19 ).

הגברה ספציפית לאלל

השיטה מבוססת על שימוש בשני זוגות פריימרים עצמאיים לאזור ספציפי של הגן: פריימר אחד בשני הזוגות נפוץ, והפריימר השני בכל זוג בעל מבנה שונה והוא משלים ל-DNA תקין או מוטנטי. סדר פעולות. כתוצאה מתגובה כזו בתמיסה, ניתן לסנתז שני סוגים של תוצרי PCR בו-זמנית - נורמלי ומוטנטי. יתר על כן, העיצוב של הפריימרים המשמשים מאפשר להבדיל בבירור בין מוצרי הגברה נורמליים למוטנטיים לפי גודלם המולקולרי. שיטה זו ברורה מאוד ומאפשרת לך לאמת את ההובלה ההומו והטרוזיגוטית של האלל המוטנטי.

שיטה לשינוי מכוון-אתר של DNA מוגבר

השיטה מבוססת על שימוש ב-PCR של מה שנקרא primer mismatch (לא משלים לחלוטין לתבנית), השונה מרצף ה-DNA של התבנית בנוקלאוטיד אחד. כתוצאה מהכללת הפריימר שצוין בהרכב של מוצר ה-PCR המוטנטי, נוצר בו אתר הגבלה שנוצר באופן מלאכותי עבור אחד מאנדונוקלאזות ההגבלה, המאפשר אבחון DNA ישיר של מוטציה ידועה מסוימת באמצעות ניתוח הגבלה. יצירת אתר הגבלה מלאכותי כזה עשויה להיות נחוצה אם החיפוש לא העלה קיומו של אנזים ידוע ונגיש, שאתר ההגבלה ה"טבעי" שלו מושפע כתוצאה מהופעת המוטציה הנחקרת במולקולת ה-DNA. .

שיטת PCR של תמלול הפוך (RT- PCR)

שיטה זו משמשת במקרים בהם נוח יותר להשתמש לא ב-DNA גנומי כאובייקט מחקר, אלא ב-cDNA קומפקטי יותר ועשיר במידע המתקבל לאחר עיבוד מתאים של דגימות רקמה, כגון חומר ביופסיה או שורות תאים של לימפוציטים, פיברובלסטים. וכו' חשוב התנאי כאן הוא הביטוי (מינימלי לפחות) של הגן הרצוי ברקמה הנחקרת.

בשלב הראשון, שעתוק הפוך של mRNA מתבצע, ומולקולות ה-cDNA המתקבלות משמשות כתבנית ל-PCR. לאחר מכן, אזור ה-cDNA הקריטי המוגבר בכמות מספקת נתון לרצף ושיטות סקר מוטציות אחרות, מחקר אלקטרופורטי ישיר (זיהוי מחיקות, הוספות וכו') או אינטגרציה למערכת ביטוי על מנת לקבל תוצר חלבוני וניתוח ישיר שלו. .

שיטה זו יעילה במיוחד לזיהוי מוטציות המובילות לסינתזה של חלבון "קטום" (מוטציות שטויות, מוטציות שחבור, מחיקות גדולות) - מה שנקרא ניתוח PTT (Protein Truncation Test). ניתוח PTT משמש בדרך כלל בעת בחינת גנים רב-אקסונים מורחבים, כגון הגן לניוון שרירים דושן/בקר, אטקסיה-טלנגיאקטזיה או נוירופיברומטוזיס מסוג 1.

PCR בזמן אמת(PCR בזמן אמת)

מדי שנה, בתחום הבריאות המעשי, PCR בזמן אמת הופך לשיטת אבחון פופולרית יותר ויותר. המאפיין הבסיסי שלו הוא ניטור וניתוח כמותי של הצטברות תוצרי תגובת שרשרת פולימראז ורישום ופרשנות אוטומטית של התוצאות. שיטה זו אינה מצריכה שלב אלקטרופורזה, מה שמפחית את הדרישות למעבדת PCR. הודות לחיסכון בשטח הייצור, ירידה במספר כוח האדם והביקוש לכימות DNA/RNA, שיטה זו נוצלה בהצלחה בשנים האחרונות במרכזי המגפה הסניטריים, האבחון והמחקר הגדולים במדינות המפותחות בעולם, החלפת PCR במתכונתו ("הקלאסית") הנוכחית.

PCR בזמן אמת משתמש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים עם תיוג פלואורסצנטי כדי לזהות DNA במהלך הגברה. PCR בזמן אמת מאפשר ניתוח מלא של דגימה תוך 20-60 דקות ומסוגל תיאורטית לזהות אפילו מולקולת DNA או RNA בודדת בדגימה.

אורז. 17. PCR בזמן אמת.

PCR בזמן אמת משתמש במערכת TaqMan כדי לשלוט בקינטיקה של PCR ישירות במהלך ההגברה באמצעות כיבוי פלואורסצנטי תהודה. לצורך זיהוי, נעשה שימוש בבדיקה הנושאת פלואורופור ו-quencher משלימים לחלק האמצעי של הפרגמנט המוגבר. כאשר הפלואורופור והמרווה קשורים לבדיקת האוליגונוקלאוטיד, נצפית רק כמות קטנה של פליטת ניאון. במהלך תהליך ההגברה, עקב פעילות 5'-exonuclease של Taq polymerase, התווית הפלורסנטית עוברת לתמיסה, משתחררת מסביבת המרווה, ומייצרת אות פלואורסצנטי שגדל בזמן אמת ביחס להצטברות של להגביר (איור 17).

יתרונות עיקריים של PCR-Real-Time על פני PCR עם אלקטרופורזה של ג'ל:

השיטה כולה מתרחשת במבחנה אחת;

· השיטה אורכת שעה;

מספיק 1-2 חדרי עבודה;

יחד עם הערכה איכותית של התוצאה, ניתן לכמת אותה (לדוגמה, כאשר רושמים טיפול אנטי-ויראלי לאיידס או דלקת כבד נגיפית, יש צורך לדעת את העומס הנגיפי, כלומר כמות הנגיף ליחידה אחת, המספקת אמיתית -זמן PCR);

· מפחית באופן דרמטי את הסיכון לזיהום.

סיכום

שיטת PCR היא אחת השיטות הנפוצות ביותר במחקר ביולוגי מולקולרי. שיטה זו צריכה לשמש באופן משמעותי על ידי קלינאים, ורופא המחליט להשתמש ב-PCR בעבודתו חייב להיות בעל ידע מסוים לגבי התכונות והיכולות של שיטה זו. שנית, חייב להיות משוב הדוק בין הקלינאי למעבדת ה-PCR, הכרחי לניתוח מקרים מורכבים ולפיתוח אסטרטגיית אבחון נכונה. שלישית, ניתוח PCR אינו תרופת פלא באבחון (בעיקר של מחלות זיהומיות) ואינו מחליף את שיטות המחקר הקיימות, אלא רק משלים אותן. והכי חשוב, PCR לא יכול להחליף את האינטואיציה והחשיבה האנליטית שצריכים להיות לרופא שמצפה להצלחה.

פ . ס . מחקרים מולקולריים-ביולוגיים - שינוי נקודות התייחסות של אבחון וטיפול. השימוש בשיטות ביולוגיות מולקולריות קשור לסיכוי לשינוי קיצוני בדגש באבחון מעבדתי. אנחנו יכולים לדבר לא רק על מידע בזמן, אלא על קבלתו מראש. אם כעת מחקרי מעבדה ברוב המקרים מתבצעים כבר עם מחלה מתקדמת וטיפול החל, הרי שמידע מעבדה ביולוגי מולקולרי צפוי לאפשר לזהות את נטייתו של אדם לסוגים מסוימים של פתולוגיה ואת מידת הרגישות לתרופות מסוימות, אשר יאפשר לבסס אופי חזוי, מונע ומותאם אישית של רפואת העתיד.

שינוי מוקדי האבחון והטיפול

מחלות תורשתיות

היום בעתיד

אבחון דרכון גנטי

8. כמה חדרי עבודה נדרשים למעבדת PCR עם זיהוי פלואורסצנטי (ניתוח כמותי, PCR בזמן אמת)?

9. מהו איתור?

10. באילו שיטות של אבחון DNA נבדלות?

11. איזה אנזים עובד על בסיס PCR?

12. מדוע צריך להפריד את אזור הגילוי מאזורי עבודה אחרים?

13. מהו אתר הגבלה?

14. מה ההבדל בין השיטה הישירה של אבחון DNA לזו העקיפה?

15. מה זה רצף?

16. מהו Multiplex PCR?

17. אילו סוגי מוטציות נקבעים על ידי PCR?

18. מהו זיהום?

19. מהי המהות של שיטת ההגברה הספציפית לאלל?

20. תנאי אחסון לחומר PCR?

21. באיזה מכשיר משתמשים להגברה?

22. מהי שיטת ה-Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)?

23. מהו החומר לאבחון PCR?

24. רשום את סוגי הזיהום?

מבחנים ללימוד עצמי

1. אנדונוקליזות הגבלה:

א) אנזימים ש"שוברים" DNA במקומות ספציפיים בהחלט;

ב) אנזימים התופרים שברים במולקולת ה-DNA;

ג) אנזימים המספקים תרכובות המבצעות תיקון DNA.

2. הגברה של גנים:

3. איזו מהשיטות של גנטיקה מולקולרית משמשת לאבחון מחלות הנגרמות על ידי גן מוטנטי ברצף ידוע?

א) השימוש בהגבלה ספציפית;

ב) גילוי ישיר באמצעות בדיקות מולקולריות ספציפיות;

V) ניתוח משפחההתפלגות של פולימורפיזם של אורך מקטע הגבלה נורמלי.

4. רצף DNA:

א) זיהוי רצף בסיסי ה-DNA;

ב) חזרה חוזרת על כל מקטע DNA;

ג) בידוד של קטע DNA המכיל את הגן הנחקר.

5. ניתן לקבל דגימות DNA באמצעות :

ב) chorion villi;

ג) מי שפיר;

ד) תאי מי שפיר;

ה) ביופסיות של עור, שרירים, כבד,

ה) הכל נכון, חוץ מנקודה "ג",

ז) הכל נכון, חוץ מנקודה "ד",

ח) כל האמור לעיל נכונים.

6. אילו מוטציות מאובחנות על ידי PCR?

א) גנומי;

ב) כרומוזומלי;

ג) גן (נקודה).

7. פריימר הוא:

א) קטע משלים של DNA;

ב) אוליגונוקלאוטיד סינטטי מסומן (רדיואקטיבי או פלואורסצנטי) רצף משלים לגן מוטנטי או תקין;

ג) אוליגונוקלאוטיד הפועל כ"זרע" ומתחיל סינתזה של שרשרת פולינוקלאוטידים על תבנית DNA או RNA.

8. מי פיתח את העיקרון של שיטת PCR?

ב) ק' מוליס

9. האם שיטת ה-PCR משמשת לאבחון התרחבות של חזרות טרינוקלאוטידים (סוג דינמי של מוטציות)?

10. באילו תחומים משתמשים ב-PCR?

א) רפואה קלינית;

ב) הגדרה של אורגניזמים מהונדסים (GMO)

ג) זיהוי האדם, קביעת אבהות, פליליסטיות

ד. כל התשובות נכונות

ד) אף אחד מהאמור לעיל.

תשובות לדוגמא: 1 - א; 2 - ב; 3 - ב; 4 - א; 5 - ה; 6 - ב; 7 - ב; 8 - ב; 9 – א, 10 – ד.

רָאשִׁי

1. גנטיקה בוצ'קוב. מוסקבה. GEOTAR, 2002.

נוֹסָף

1., בכרב והטיפול במחלות מולדות ותורשתיות בילדים. - מוסקבה, 2004.

2. אבחון DNA וייעוץ גנטי רפואי. - מוסקבה, 2004.

3. גנטיקה של גינטר. - מוסקבה, 2003.

4. יסודות גורבונוב של גנטיקה רפואית. - סנט פטרסבורג: Intermedica, 1999.

5. ג'יי מקגי. מולקולרית אבחון קליני. – עולם, 1999.

6. מנשיקוב - מחקר ביולוגי באבחון מעבדה קליני: אפשרויות הבעיה (הרצאות). אבחון מעבדה קליני, מס' 3, 2006.

7. קורנינקו של עבודת מעבדת ה-PCR במהלך ניתוח בליין של חומר ביולוגי. אבחון מעבדה קליני, מס' 10, 2006.

8. ארגון עבודת מעבדת ה-PCR. הוראות שיטתיות. MU 1.3.1794-03. רופא סניטרי ראשי של הפדרציה הרוסית, 2003.

9. טכנולוגיית ארליך ח.א. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR כמותי בזמן אמת. Genome Res. - מס' 6, 1996.

עקרונות עיקריים של השיטה

תגובת שרשרת פולימראז

מדריך מתודולוגי לעבודה חוץ כיתתית של תלמידי 3-4 קורסים בהתמחויות רפואה כללית (060101) ורפואת ילדים (060103).

SEI HPE "האקדמיה הרפואית של מדינת קרסנויארסק של הסוכנות הפדרלית לבריאות ופיתוח חברתי"

רוסיה, קרסנויארסק,

הסוכנות הפדרלית לחינוך

מדינה מוסד חינוכי

עֶלִיוֹן חינוך מקצועי

"האקדמיה הפדגוגית הממלכתית של קרליאן"

שיעורים בנושא:

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ויישומה

הושלמה על ידי: הסטודנטית קוריאגינה ולריה אלכסנדרובנה

נבדק על ידי: קרפיקובה נטליה מיכאילובנה

פטרוזבודסק 2013

מבוא

פרק 1 סקירת ספרות

1.5.4 אפקט מישור

1.5.6 הגברה

סיכום

מבוא

עשרים השנים האחרונות אופיינו בהחדרה הנרחבת של שיטות גנטיות מולקולריות למדעי הביולוגיה, הרפואה והחקלאות.

בתחילת שנות ה-70, נראה היה שהביולוגיה המולקולרית הגיעה לדרגה מסוימת של שלמות. בתקופה זו, מיקרואורגניזמים היו האובייקט העיקרי של המחקר הגנטי המולקולרי. המעבר לאאוקריוטים הציב בפני החוקרים בעיות חדשות לחלוטין שלא ניתן היה לפתור באמצעות שיטות הניתוח הגנטי שהיו קיימות באותה תקופה. פריצת דרך בפיתוח הגנטיקה המולקולרית התאפשרה עקב הופעתו של כלי ניסוי חדש - אנדונוקלאזים של ריסטרציה. בשנים שלאחר מכן, מספר שיטות ניתוח DNA ישירות המבוססות על גישות שונות מבחינה איכותית החל לעלות במהירות.

במקרים רבים, טכנולוגיות מודרניות אפשרו להתחיל לחקור את הארגון המבני והתפקודי העדין של הגנום הגרעיני והחוץ-גרעיני של אורגניזמים שונים ברמה עמוקה יותר. לכך הייתה חשיבות מיוחדת לפיתוח שיטות אבחון וטיפול חדשות. מחלות שונות. לא פחות חשובה הייתה האפשרות להשתמש בהישגי הגנטיקה המולקולרית בביולוגיה ובגידול האוכלוסייה כדי לזהות ולנתח את השונות הגנטית של אוכלוסיות, זנים וזנים, לזהות ולאשר פרטים בעלי ערך כלכלי, ליצור אורגניזמים מהונדסים גנטית ולפתור סוגיות נוספות.

לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות משלה. אין שיטה אוניברסלית שיכולה לפתור את כל הבעיות שעולות. לכן, בחירת שיטה ספציפית למחקר המתמשך היא אחד השלבים החשובים ביותר בכל עבודה מדעית.

פרק 1 סקירת ספרות

1.1 היסטוריה של גילוי תגובת שרשרת הפולימראז (PCR)

בשנת 1983 ק.ב. Mullis וחב' פרסמו ורשמו פטנט על שיטת תגובת שרשרת הפולימראז (PCR), אשר נועדה להשפיע באופן עמוק על כל תחומי המחקר והיישום של חומצות גרעין. הערך של שיטה זו עבור ביולוגיה מולקולריתוהגנטיקה התבררה כל כך גדולה וברורה, שאחרי שבע שנים הסופר זכה בפרס פרס נובלבכימיה.

בתחילת השימוש בשיטה, לאחר כל מחזור חימום-קירור, היה צורך להוסיף DNA פולימראז לתערובת התגובה, שכן הוא הושבת בטמפרטורה הגבוהה הדרושה להפרדת שרשראות סליל ה-DNA. הליך התגובה היה יחסית לא יעיל, דרש הרבה זמן ואנזים. בשנת 1986, שיטת תגובת שרשרת הפולימראז שופרה משמעותית. הוצע להשתמש בפולימראזות DNA מחיידקים תרמופילים. אנזימים אלו התגלו כיציבים בתרמי ויכלו לעמוד במחזורי תגובה רבים. השימוש בהם איפשר לפשט ולהפוך את ה-PCR לאוטומטי. אחד מפולימראזות ה-DNA התרמו-יציבות הראשונות בודד מחיידקים תרמוס אקווטיקוסונקרא בשם טאק-פולימראז.

האפשרות להגביר כל מקטע DNA שרצף הנוקלאוטידים שלו ידוע, ולהשיג אותו לאחר PCR בצורה הומוגנית ובכמות הכנה, הופכת את PCR לשיטה חלופית לשיבוט מולקולרי של שברי DNA קצרים. אין צורך ליישם טכניקות מתודולוגיות מורכבות המשמשות ב הנדסה גנטיתעם שיבוט קונבנציונלי. פיתוח שיטת ה-PCR הרחיב מאוד את האפשרויות המתודולוגיות של הגנטיקה המולקולרית, ובפרט ההנדסה הגנטית, עד כדי כך שהיא שינתה וחיזקה באופן קיצוני את הפוטנציאל המדעי של רבים מתחומיה.

1.2 זנים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

· PCR מקונן- משמש להפחתת מספר תוצרי הלוואי של התגובה. השתמש בשני זוגות של פריימרים ובצע שתי תגובות רצופות. זוג הפריימרים השני מגביר את אזור ה-DNA בתוך תוצר התגובה הראשונה.

· PCR הפוך- משמש כאשר ידוע רק אזור קטן בתוך הרצף הרצוי. שיטה זו שימושית במיוחד כאשר יש צורך לקבוע רצפים שכנים לאחר הכנסת DNA לגנום. ליישום של PCR הפוך, מתבצעת סדרה של חיתוכים של DNA עם אנזימי הגבלה<#"justify">פריימר לתגובת שרשרת פולימראז

· PCR ספציפי לקבוצה- PCR לקרובים<#"center">1.3 תגובת שרשרת פולימראז

התגלתה באמצע שנות ה-80, תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) יכולה להגדיל את מספר העותקים של דגימה מקורית מיליוני פעמים תוך מספר שעות. במהלך כל מחזור של התגובה נוצרים שני עותקים מהמולקולה המקורית. כל אחד מעותקי ה-DNA המסונתז יכול לשמש כתבנית לסינתזה של עותקי DNA חדשים במחזור הבא. לפיכך, חזרה חוזרת על מחזורים מובילה לעלייה במספר העותקים פנימה התקדמות גיאומטרית. מהחישובים עולה שגם אם יהיו 30 מחזורים, מספר העותקים של המולקולה המקורית יהיה יותר ממיליארד. גם אם ניקח בחשבון שלא כל האמפליקונים משוכפלים במהלך כל מחזור, המספר הכולל של העותקים, למרות זאת, הוא נתון די גדול.

כל מחזור של תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) מורכב מהשלבים הבאים:

· דנטורציה - עלייה בטמפרטורה גורמת למולקולת DNA דו-גדילית להתנתק ולהתפצל לשניים חד-גדיליים;

· חישול - הורדת הטמפרטורה מאפשרת לפריימרים להיצמד לאזורים משלימים של מולקולת ה-DNA;

· התארכות - האנזים DNA פולימראז משלים את הגדיל המשלים.

להגברה של המקטע הנבחר, משתמשים בשני פריימרים (זרעים) של אוליגונוקלאוטידים שמאגפים אזור DNA מסוים. מכוון פריימרים 3 - מסתיימים אחד כלפי השני ובכיוון הרצף שצריך להגביר. DNA פולימראז מבצע סינתזה (השלמה) של שרשראות DNA המשלימות הדדית, החל מפריימרים. במהלך סינתזת ה-DNA, פריימרים מוכנסים פיזית לשרשרת מולקולות ה-DNA החדשות שסונתזו. כל גדיל של מולקולת ה-DNA שנוצר באמצעות אחד מהפריימרים יכול לשמש כתבנית לסינתזה של גדיל DNA משלים באמצעות הפריימר השני.

1.4 ביצוע תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

תגובת השרשרת של הפולימראז מתבצעת במבחנות מיוחדות של פוליפרופילן דק דופן, התואמות בגודלן למחזור התרמי המשומש (מגבר) - מכשיר השולט במאפייני הטמפרטורה והזמן של שלבי תגובת השרשרת של הפולימראז (PCR) .

1.5 עקרון שיטת תגובת שרשרת הפולימראז

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטת הגברה של DNA במבחנה שיכולה לבודד ולהכפיל רצף DNA ספציפי מיליארדי פעמים תוך מספר שעות. האפשרות להשיג מספר עצום של עותקים של אחד בהחלט אזור מסויםהגנום מפשט מאוד את המחקר של דגימת DNA קיימת.

כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז, יש לעמוד במספר תנאים:

1.5.1 נוכחות של מספר רכיבים בתערובת התגובה

המרכיבים העיקריים של תערובת התגובה (PCR) הם: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, תערובת של טריפוספטים נוקלאוטידים (ATP, GTP, CTP, TTP), פריימרים (אוליגונוקלאוטידים), הכנת DNA מנותחת, פולימראז DNA תרמי. כל אחד ממרכיבי תערובת התגובה מעורב ישירות בתגובת שרשרת הפולימראז (PCR), וריכוז הריאגנטים משפיע ישירות על מהלך ההגברה.

· Tris-HCl - קובע את ה-pH של תערובת התגובה, יוצר קיבולת חיץ. פעילות ה-DNA פולימראז תלויה ב-pH של המדיום, ולכן ערך ה-pH משפיע ישירות על מהלך תגובת השרשרת של הפולימראז. בדרך כלל ערך ה-pH הוא בטווח של 8 - 9.5. ה-pH הגבוה נובע מכך שככל שהטמפרטורה עולה, ה-pH של חיץ Tril-HCl יורד.

· KCl - ריכוז אשלגן כלורי עד 50 מ"מ משפיע על מהלך תהליכי הדנטורציה והחישול, הריכוז מעל 50 מ"מ מעכב DNA פולימראז.

· MgCl 2- כי DNA פולימראז הוא Mg 2+- אנזים תלוי, אז ריכוז יוני המגנזיום משפיע על פעילות האנזים (Mg 2+יוצר קומפלקסים עם NTP - הקומפלקסים הללו הם המצע לפולימראז). ריכוז גבוה מוביל לעלייה בהגברה לא ספציפית, וריכוז נמוך מוביל לעיכוב של התגובה, האופטימום (עבור פולימראזות שונות) הוא באזור של 0.5 - 5 מ"מ. בנוסף, ריכוז מלחי המגנזיום משפיע על מהלך תהליכי הדנטורציה והחישול - עלייה בריכוז Mg 2+גורם לעלייה בטמפרטורת ההיתוך של ה-DNA (כלומר, הטמפרטורה שבה 50% מגדילי ה-DNA הדו-גדילים נשברים לגדילים חד-גדילים).

· NTP - נוקלאוטיד טריפוספטים הם מונומרים ישירים של חומצות גרעין. כדי למנוע הפסקת שרשרת, מומלץ יחס שווה של כל ארבעת הטריפוספטים הנוקלאוטידים. הריכוז הנמוך של רכיבים אלה בתערובת התגובה מגביר את ההסתברות לטעויות בבניית גדיל ה-DNA המשלים.

· פריימרים - האופטימלי ביותר הוא השימוש בפריימרים עם הפרש נקודת התכה של לא יותר מ-2 - 4 o ג. לפעמים במהלך אחסון לטווח ארוך בטמפרטורה של 4 o עם, או לאחר מספר רב של הקפאה - הפשרה, הפריימרים יוצרים מבנים משניים - דימרים, מה שמפחית את יעילות ה-PCR. ביטול בעיה זו מצטמצם לדגירה באמבט מים (T=95 o ג) למשך 3 דקות ולאחר מכן קירור מהיר ל-0o עם.

· תכשירי DNA - כמות ואיכות תכשיר ה-DNA (מטריקס) משפיעות ישירות על מהלך ופרמטרים של תגובת השרשרת הפולימראז. עודף דגימת DNA מעכב את תגובת שרשרת הפולימראז (PCR). זיהומים חומרים שונים, שנמצאים בתכשיר ה-DNA, יכולים גם להפחית את היעילות של תגובת שרשרת הפולימראז (PCR): נתרן אצטט, נתרן כלוריד, איזופרופנול, אתנול, הפרין, פנול, אוריאה, המוגלובין וכו'.

· DNA פולימראז - כאשר משתמשים בכמות קטנה של DNA פולימראז, נצפית ירידה בסינתזה של התוצר הסופי ביחס ישר לגודל השברים. עודף של פולימראז פי 2-4 מוביל להופעת ספקטרום מפוזר, ובפי 4-16 ספקטרים ​​לא ספציפיים במשקל מולקולרי נמוך. טווח הריכוזים המשמשים הוא 0.5 - 1.5 יחידות פעילות במונחים של 25 μl מתערובת ה-PCR.

בנוסף למרכיבים העיקריים של תערובת ה-PCR, נעשה שימוש במספר חומרים נוספים המשפרים את האינדיקטורים האיכותיים והכמותיים של PCR: אצטמיד (5%) - עלייה במסיסות המרכיבים העיקריים; בטאין ( מלח נתרן) - ייצוב של DNA פולימראז, הורדת נקודת ההיתוך של DNA, השוואת נקודת ההיתוך; אלבומין בקר (10-100 מיקרוגרם / מ"ל) - ייצוב של DNA פולימראז; dimethyl sulfoxide (1-10%) - הגדלת המסיסות של הרכיבים העיקריים; פורמאמיד (2-10%) - עלייה בספציפיות של חישול; גליצרול (15-20%) - עלייה ביציבות התרמית של האנזים, ירידה בטמפרטורת הדנטורציה של דגימת DNA; אמוניום גופרתי - הורדת טמפרטורת הדנטורציה והחישול.

1.5.2 מחזור וטמפרטורה

ההשקפה הכללית של תוכנית תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) היא כדלקמן:

שלב. דנטורציה ראשונית ממושכת של תכשיר ה-DNA.1 מחזור

שלב. דנטורציה מהירה של תכשיר ה-DNA. חישול פריימר. התארכות.30 - 45 מחזורים.

שלב. התארכות ממושכת. קירור תערובת התגובה מחזור אחד.

לכל אלמנט של השלב - דנטורציה, חישול, התארכות - יש מאפייני טמפרטורה וזמן אינדיבידואליים. הפרמטרים של הטמפרטורה וזמן הזרימה של כל אלמנט נבחרים באופן אמפירי, בהתאם לאינדיקטורים האיכותיים והכמותיים של מוצרי ההגברה.

דנטורציה. במהלך אלמנט זה של תגובת שרשרת הפולימראז, מולקולת DNA דו-גדילית מפוצלת לשניים חד-גדיליים. פרמטרי טמפרטורה של דנטורציה הם בטווח של 90 - 95 o C, אך במקרה של דגימת DNA עם תכולה גבוהה של גואנין וציטוזין, יש להעלות את הטמפרטורה ל-98 o ג. טמפרטורת הדנטורציה צריכה להספיק כדי לבצע דנטורציה מוחלטת - בקעו את גדילי ה-DNA והימנעו מ"קירור פתאומי" או חישול מהיר, אולם פולימראז DNA תרמי יציב פחות יציב בטמפרטורות גבוהות. לפיכך, הבחירה של פרמטרים אופטימליים של טמפרטורת דנטורציה עבור יחס פריימר/דגימה (הכנת DNA) היא תנאי חשוב להגברה. אם טמפרטורת הדנטורציה בשלב הראשון היא מעל 95 o ג, מומלץ להוסיף DNA פולימראז לתערובת התגובה לאחר דנטורציה ראשונית. משך האלמנט הזה של השלב במהלך תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) אמור להספיק לדנטורציה מלאה של ה-DNA, אך יחד עם זאת לא להשפיע באופן משמעותי על פעילות ה-DNA פולימראז בטמפרטורה נתונה.

רִכּוּך. טמפרטורת חישול (T א ) הוא אחד הפרמטרים החשובים ביותר של תגובת שרשרת הפולימראז. טמפרטורת החישול עבור כל פריימר ספציפי נבחרת בנפרד. זה תלוי באורך ובהרכב הנוקלאוטידים של הפריימר. בדרך כלל הוא נמוך ב-2 - 4 o מערך נקודת ההיתוך (T M ) פריימר. אם טמפרטורת החישול של המערכת היא מתחת לאופטימום, אזי מספר השברים המוגברים הלא ספציפיים גדל, ולהפך, יותר חוֹםמפחית את כמות המוצרים המוגברים. במקרה זה, הריכוז של אמפליקונים ספציפיים יכול לרדת בחדות, עד לעיכוב של תגובת שרשרת הפולימראז (PCR). הגדלת זמן החישול מובילה גם לעלייה במספר האמפליקונים הלא ספציפיים.

הַאֲרָכָה. בדרך כלל, לכל סוג של פולימראז DNA תרמי יציב יש טמפרטורה אינדיבידואלית של פעילות אופטימלית. קצב הסינתזה של גדיל DNA משלים על ידי אנזים הוא גם ערך ספציפי לכל פולימראז (בממוצע הוא 30-60 נוקלאוטידים לשנייה, או 1-2 אלף בסיסים לדקה), כך שזמן ההתארכות נבחר בהתאם על סוג ה-DNA פולימראז ואורך האזור המוגבר.

1.5.3 עקרונות בסיסיים של בחירת פריימר

בעת יצירת מערכת בדיקת PCR, אחת המשימות העיקריות היא בחירה נכונה של פריימרים שחייבים לעמוד במספר קריטריונים:

פריימרים חייבים להיות ספציפיים. תשומת - לב מיוחדתלשלם 3 - הקצוות של הפריימרים, מכיוון שמהם מתחיל Taq פולימראז להשלים את שרשרת ה-DNA המשלימה. אם הספציפיות שלהם אינה מספקת, סביר להניח שתהליכים לא רצויים יתרחשו במבחנה עם תערובת התגובה, כלומר, סינתזה של DNA לא ספציפי (שברים קצרים או ארוכים). זה נראה באלקטרופורזה בצורה של להקות נוספות כבדות או קלות. זה מקשה על הערכת תוצאות התגובה, מכיוון שקל לבלבל מוצר הגברה ספציפי עם DNA זר מסונתז. חלק מה-primers ו-dNTPs נצרך לסינתזה של DNA לא ספציפי, מה שמוביל לאובדן משמעותי של רגישות.

פריימרים לא צריכים ליצור דימרים ולולאות, כלומר. אין ליצור גדילים כפולים יציבים על ידי חישול הפריימרים לעצמם או זה לזה.

1.5.4 אפקט מישור

יש לציין שתהליך הצטברות של מוצרי הגברה ספציפיים לוקח רק זמן מוגבל, ואז היעילות שלו יורדת בצורה קריטית. זה נובע מהאפקט המכונה "מישור".

אפקט טווח מִישׁוֹר משמש לתיאור תהליך הצטברות מוצרי PCR במחזורי ההגברה האחרונים.

בהתאם לתנאים ולמספר המחזורים של תגובת ההגברה, בזמן השגת האפקט מִישׁוֹר ניצול מצעים (dNTPs ופריימרים), יציבות המגיבים (dNTPs ואנזים), כמות המעכבים, כולל פירופוספטים ודופלקסים של DNA, תחרות על מגיבים עם מוצרים לא ספציפיים או פריימר-דימרים, ריכוז מוצר ספציפי , ודנטורציה לא מלאה בריכוזים גבוהים של מוצרי הגברה.

ככל שהריכוז הראשוני של DNA המטרה נמוך יותר, כך הסיכון לתגובה גבוה יותר רמה". נקודה זו יכולה להתרחש לפני שמספר מוצרי ההגברה הספציפיים מספיק לנתח. רק מערכות בדיקה שעברו אופטימיזציה טובה יכולות להימנע מכך.

1.5.5 הכנת דגימה של חומר ביולוגי

טכניקות שונות משמשות למיצוי DNA, בהתאם למשימות. המהות שלהם טמונה במיצוי (מיצוי) של DNA ממוצר ביולוגי והסרה או נטרול של זיהומים זרים לקבלת תכשיר DNA בטוהר המתאים ל-PCR.

שיטת השגת תכשיר DNA טהור, המתוארת על ידי מרמור, נחשבת לסטנדרטית וכבר הפכה לקלאסית. זה כולל פרוטאוליזה אנזימטית ואחריה דה-פרוטאיניזציה ומשקעי DNA עם אלכוהול. שיטה זו מאפשרת להשיג תכשיר DNA טהור. עם זאת, זה די מייגע וכרוך בעבודה עם חומרים אגרסיביים וחריפים כמו פנול וכלורופורם.

אחת השיטות הפופולריות כיום היא שיטת מיצוי ה-DNA המוצעת על ידי Boom et al. שיטה זו מבוססת על שימוש בחומר כאוטרופי חזק, guanidine thiocyanate (GuSCN), לתמוגגת תאים, ולאחר מכן ספיגת DNA על גבי נשא (חרוזי זכוכית, אדמה דיאטומית, חלב זכוכית וכו'). לאחר שטיפות, DNA נשאר בדגימה נספג על הנשא, ממנו ניתן להסירו בקלות באמצעות חיץ elution. השיטה נוחה, מתקדמת טכנולוגית ומתאימה להכנת דגימה להגברה. עם זאת, אובדן DNA אפשרי עקב ספיגה בלתי הפיכה על הנשא, כמו גם במהלך שטיפות רבות. זה חשוב במיוחד כאשר עובדים עם כמויות קטנות של DNA בדגימה. יתר על כן, אפילו כמויות קטנות של GuSCN יכולות לעכב PCR. לכן, כאשר משתמשים בשיטה זו, זה מאוד חשוב בחירה נכונהשמירה קפדנית וקפדנית על ניואנסים טכנולוגיים.

קבוצה נוספת של שיטות הכנת דגימות מבוססת על שימוש במחליפי יונים מסוג צ'ילקס, שבניגוד לזכוכית, אינם סופחים DNA, אלא להיפך, זיהומים המפריעים לתגובה. ככלל, טכנולוגיה זו כוללת שני שלבים: רתיחה מדגם וספיחת זיהומים על מחליף יונים. השיטה אטרקטיבית ביותר בשל פשטות הביצוע שלה. ברוב המקרים הוא מתאים לעבודה עם חומר קליני. למרבה הצער, לפעמים יש דגימות עם זיהומים שלא ניתן להסיר באמצעות מחליפי יונים. בנוסף, לא ניתן להשמיד מיקרואורגניזמים מסוימים על ידי הרתחה פשוטה. במקרים אלה, יש צורך להציג שלבים נוספים של עיבוד מדגם.

לפיכך, יש להתייחס לבחירת שיטת הכנת הדגימה מתוך הבנה של מטרות הניתוחים המיועדים.

1.5.6 הגברה

כדי לבצע את תגובת ההגברה, יש צורך להכין את תערובת התגובה ולהוסיף אליה את דגימת ה-DNA המנותחת. במקרה זה, חשוב לקחת בחשבון כמה תכונות של חישול פריימר. העובדה היא שככלל, בדגימה הביולוגית המנותחת ישנן מולקולות DNA שונות, אשר לפריימרים המשמשים בתגובה יש הומולוגיה חלקית, ובמקרים מסוימים משמעותית. בנוסף, פריימרים יכולים להיצמד זה לזה כדי ליצור פריימר-דימרים. שניהם מובילים לצריכה משמעותית של פריימרים לסינתזה של תוצרי תגובה צדדית (לא ספציפית), וכתוצאה מכך מפחיתים משמעותית את רגישות המערכת. זה מקשה או בלתי אפשרי לקרוא את תוצאות התגובה במהלך האלקטרופורזה.

1.6 הרכב תערובת תגובת PCR הסטנדרטית

x חיץ PCR (תמיסת Tris-HCl 100 מ"מ, pH 9.0, תמיסה של 500 מ"מ KCl, תמיסה של 25 מ"מ MgCl2 ) …….2.5 µl

מים (MilliQ) ……………………………………………………………….18.8 µl

תערובת של נוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs)

תמיסה mM של כל ……………………………………………………….……….0.5 µl

פריימר 1 (תמיסת 10 מ"מ) ………………………………………………….….1 µl

פריימר 2 (תמיסת 10 מ"מ) ………………………………………………….….1 µl

DNA פולימראז (5 יחידות / µl) …………………………………………………………0.2 µl

דגימת DNA (20 ng/µl) …………………………………………………..1 µl

1.7 הערכת תוצאות התגובה

על מנת להעריך נכון את תוצאות ה-PCR, חשוב להבין ששיטה זו אינה כמותית. תיאורטית, ניתן לזהות תוצרי הגברה של מולקולות DNA מטרה בודדות באלקטרופורזה כבר לאחר 30-35 מחזורים. עם זאת, בפועל הדבר נעשה רק במקרים בהם התגובה מתרחשת בתנאים קרובים לאידיאל, דבר שלא נתקלים בו לעתים קרובות בחיים. למידת הטוהר של תכשיר ה-DNA יש השפעה רבה במיוחד על יעילות ההגברה; נוכחות של מעכבים מסוימים בתערובת התגובה, שבמקרים מסוימים יכול להיות קשה מאוד להיפטר מהם. לפעמים, בשל נוכחותם, לא ניתן להגביר אפילו עשרות אלפי מולקולות DNA מטרה. לפיכך, לעתים קרובות אין קשר ישיר בין הכמות ההתחלתית של DNA המטרה לכמות הסופית של מוצרי ההגברה.

פרק 2: יישומים של תגובת שרשרת הפולימראז

PCR משמש בתחומים רבים לניתוח ובניסויים מדעיים.

קרימינליסטיות

PCR משמש להשוואת מה שנקרא "טביעות אצבע גנטיות". אנחנו צריכים דגימה של חומר גנטי מזירת הפשע - דם, רוק, זרע, שיער וכו'. זה מושווה לחומר הגנטי של החשוד. כמות קטנה מאוד של DNA מספיקה, תיאורטית - עותק אחד. ה-DNA נחתך לשברים, ואז מוגבר על ידי PCR. הפרגמנטים מופרדים על ידי אלקטרופורזה של DNA. התמונה המתקבלת של מיקומן של להקות ה-DNA נקראת טביעת האצבע הגנטית.

קביעת אבהות

תוצאות של אלקטרופורזה של שברי DNA שהוגברו על ידי PCR. אַבָּא. יֶלֶד. אִמָא. הילד ירש כמה מאפיינים של החותם הגנטי של שני ההורים, מה שנתן חותם חדש וייחודי.

למרות ש"טביעות אצבע גנטיות" הן ייחודיות, עדיין ניתן ליצור קשרים משפחתיים על ידי יצירת מספר טביעות אצבע כאלה. ניתן ליישם את אותה שיטה, עם שינויים קלים, כדי לבסס יחסים אבולוציוניים בין אורגניזמים.

אבחון רפואי

PCR מאפשר להאיץ ולהקל משמעותית את האבחנה של מחלות תורשתיות וויראליות. הגן המעניין מוגבר על ידי PCR באמצעות פריימרים מתאימים ולאחר מכן רצף לקביעת מוטציות. ניתן לזהות זיהומים ויראליים מיד לאחר ההדבקה, שבועות או חודשים לפני הופעת תסמיני המחלה.

רפואה מותאמת אישית

לפעמים תרופות הן רעילות או אלרגניות עבור חלק מהמטופלים. הסיבות לכך הן בחלקן בהבדלים אינדיבידואליים ברגישות ובמטבוליזם של תרופות ונגזרותיהן. הבדלים אלו נקבעים ברמה הגנטית. לדוגמה, בחולה אחד, ציטוכרום מסוים עשוי להיות פעיל יותר, באחר - פחות. על מנת לקבוע איזה סוג של ציטוכרום יש לחולה נתון, מוצע לבצע ניתוח PCR לפני השימוש בתרופה. ניתוח זה נקרא גנוטיפ ראשוני.

שיבוט גנים

שיבוט גנים הוא תהליך של בידוד גנים וכתוצאה ממניפולציות של הנדסה גנטית, השגת כמות גדולה מהתוצר של גן נתון. PCR משמש להגברת גן, אשר מוחדר לאחר מכן לווקטור, פיסת DNA הנושאת את הגן הזר לאותו אורגניזם או אורגניזם אחר שקל לגדל. בתור וקטורים, למשל, משתמשים בפלסמידים או ב-DNA ויראלי. החדרת גנים לאורגניזם זר משמשת בדרך כלל להשגת תוצר של גן זה - RNA או, לרוב, חלבון. בדרך זו מתקבלים חלבונים רבים בכמויות תעשייתיות לשימוש ב חַקלָאוּת, רפואה וכו'.

רצף DNA

בשיטת הריצוף באמצעות דידיאוקסינוקלאוטידים המסומנים פלואורסצנטית או רדיואקטיבית, PCR הוא חלק בלתי נפרד, שכן במהלך הפילמור מוכנסות נגזרות נוקלאוטידים המסומנות בתווית פלואורסצנטית או רדיואקטיבית לשרשרת ה-DNA. זה עוצר את התגובה, ומאפשר לקבוע את מיקומם של נוקלאוטידים ספציפיים לאחר הפרדת הגדילים המסונתזים בג'ל.

מוטגנזה

נכון לעכשיו, PCR הפך לשיטת המוטגנזה העיקרית. השימוש ב-PCR איפשר לפשט ולהאיץ את הליך המוטגנזה, כמו גם להפוך אותו לאמין יותר וניתן לשחזור.

שיטת ה-PCR אפשרה לנתח את נוכחותם של רצפי וירוס הפפילומה האנושי בקטעים של ביופסיות של ניאופלסמות צוואר הרחם האנושיות המוטבעות בפרפין 40 שנה לפני מחקר זה. יתרה מכך, בעזרת PCR ניתן היה להגביר ולשבט שברי DNA מיטוכונדריאלי משאריות המאובנים של המוח האנושי בגיל 7,000 שנה!

על ליזטים של זרעונים אנושיים בודדים, הודגמה האפשרות לנתח בו-זמנית שני לוקוסים הממוקמים על כרומוזומים לא-הומולוגיים שונים. גישה זו מספקת הזדמנות ייחודית לניתוח גנטי עדין ולמחקר של רקומבינציה כרומוזומלית, פולימורפיזם של DNA וכו'. השיטה לניתוח זרעונים בודדים נמצאה מיד שימוש מעשיברפואה משפטית, מאחר שהקלדת HLA של תאים הפלואידים מאפשרת קביעת אבהות או זיהוי פושע (תסביך HLA הוא קבוצה של גנים של קומפלקס היסטו-תאימות עיקריים של האדם; הלוקוסים של קומפלקס HLA הם הפולימורפיים מבין כולם בבעלי חוליות גבוהים יותר: מינים, בכל לוקוס יש מספר יוצא דופן של אללים שונים - צורות חלופיות של אותו גן).

באמצעות PCR, ניתן לזהות את נכונות האינטגרציה של מבנים גנטיים זרים באזור קבוע מראש של הגנום של התאים הנחקרים. ה-DNA הכולל תאי מסובך עם שני פריימרים של אוליגונוקלאוטידים, שאחד מהם משלים לאתר ה-DNA המארח ליד נקודת ההחדרה, והשני לרצף של המקטע המשולב בגדיל ה-DNA האנטי מקביל. תגובת שרשרת הפולימראז במקרה של מבנה DNA כרומוזומלי ללא שינוי באתר ההחדרה המוצע מובילה ליצירת שברי DNA חד-גדיליים בגודל בלתי מוגדר, ובמקרה של החדרה מתוכננת, שברי DNA דו-גדילי של חומר ידוע. גודל, נקבע לפי המרחק בין אתרי החישול של שני הפריימרים. יתרה מכך, מידת ההגברה של האזור המנותח של הגנום במקרה הראשון תהיה תלויה באופן ליניארי במספר המחזורים, ובשני - אקספוננציאלית. ההצטברות האקספוננציאלית במהלך PCR של קטע מוגבר בגודל קבוע מראש מאפשרת לצפות בו חזותית לאחר חלוקה אלקטרופורטית של תכשיר DNA ולהסיק מסקנה חד משמעית לגבי החדרת רצף זר לאזור נתון של DNA כרומוזומלי.

סיכום

שיטת PCR היא כיום הנפוצה ביותר כשיטה לאבחון מחלות זיהומיות שונות. PCR מאפשר לזהות את האטיולוגיה של הזיהום, גם אם הדגימה שנלקחה לניתוח מכילה רק כמה מולקולות DNA של הפתוגן. PCR נמצא בשימוש נרחב באבחון מוקדם של זיהומי HIV, דלקת כבד נגיפית וכו'. נכון להיום, אין כמעט גורם זיהומי שלא ניתן לזהות באמצעות PCR.

רשימת ספרות משומשת

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. שיטות של ניתוח מולקולרי - גנטי. - מינסק: יוניפול, 2007. - 176 עמ'.

2.PCR "בזמן אמת" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. וכו.; ed. ב. נ. D.V. רבריקוב; הַקדָמָה לָה. אוסטרמן ואקד. RAS ו-RAAS E.D. סברדלוב; מהדורה שנייה, ריב. ועוד - מ.: בינום. מעבדת ידע, 2009. - 223 עמ'.

.פטרושב ל.י. מערכות גנטיות מלאכותיות. - מ.: נאוקה, 2005. - ב-2 טון

.B. Glick, J. Pasternak ביוטכנולוגיה מולקולרית. עקרונות ויישום 589 עמודים, 2002

5.שצ'לקונוב ס.נ. הנדסה גנטית. - נובוסיבירסק: Sib. univ. הוצאת ספרים, 2004. - 496 עמ'.

נערך על ידי א.א. וורבייבה "תגובת שרשרת פולימראז ויישומה לאבחון בדרמטונרולוגיה"; סוכנות הידיעות הרפואית - 72 עמודים

Http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. סו/ - כתב עת רפואי

שיעורי עזר

צריכים עזרה בלימוד נושא?

המומחים שלנו ייעצו או יספקו שירותי הדרכה בנושאים שמעניינים אותך.
הגש בקשהמציין את הנושא עכשיו כדי לברר על האפשרות לקבל ייעוץ.

עבור נאות ו טיפול יעילמחלות זיהומיות רבות דורשות גילוי בזמן אבחנה מדויקת. בפתרון בעיה זו כיום מעורבות שיטות אבחון היי-טק המבוססות על שיטות ביולוגיה מולקולרית. כרגע, תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) כבר נמצאת בשימוש נרחב ברפואה מעשית ככלי האבחון המעבדתי האמין ביותר.

מה מסביר את הפופולריות של PCR בזמן הנוכחי?

ראשית, שיטה זו משמשת לזיהוי פתוגנים של מחלות זיהומיות שונות עם דיוק גבוה.

שנית, לעקוב אחר יעילות הטיפול.

במדריכים שונים, פרוספקטים, מאמרים וכן הסברים של מומחים רפואיים, אנו נתקלים לא פעם בשימוש במונחים ובמילים בלתי מובנות. באמת קשה לדבר על מוצרי היי-טק של מדע במילים רגילות.

מהי המהות והמכניקה של אבחון PCR?

לכל אורגניזם חי יש גנים ייחודיים משלו. גנים ממוקמים במולקולת ה-DNA, שהיא למעשה "כרטיס הביקור" של כל אורגניזם ספציפי. DNA (חומר גנטי) הוא מולקולה ארוכה מאוד המורכבת מאבני בניין הנקראים נוקלאוטידים. עבור כל פתוגן של מחלות זיהומיות, הם ממוקמים ספציפיים בהחלט, כלומר, ברצף מסוים ובשילוב. כאשר יש צורך להבין האם לאדם יש פתוגן מסוים, נלקח חומר ביולוגי (דם, שתן, רוק, מריחה) המכיל DNA או שברי DNA של החיידק. אבל כמות החומר הגנטי של הפתוגן קטנה מאוד, ואי אפשר לומר לאיזה מיקרואורגניזם הוא שייך. כדי לפתור בעיה זו, משרת PCR. המהות של תגובת שרשרת הפולימראז היא שנלקחת כמות קטנה של חומר למחקר המכיל DNA, ובמהלך תהליך ה-PCR, כמות החומר הגנטי השייך לפתוגן מסוים עולה וכך ניתן לזהות אותו.

אבחון PCR הוא מחקר גנטי של חומר ביולוגי.

הרעיון של שיטת ה-PCR שייך למדען האמריקאי K. Mullins, שהציע ב-1983. עם זאת, הוא קיבל שימוש קליני נרחב רק באמצע שנות ה-90 של המאה העשרים.

נעסוק בטרמינולוגיה, מה זה - DNA וכו'. לכל תא של כל יצור חי (בעל חיים, צמח, אדם, חיידקים, וירוסים) יש כרומוזומים. כרומוזומים הם השומרים של מידע גנטי שמכיל את כל רצף הגנים של כל יצור חי מסוים.

כל כרומוזום מורכב משני גדילי DNA שמפותלים זה לזה לסליל. ה-DNA הוא חומצה דאוקסיריבונוקלאית מבחינה כימית, המורכבת ממרכיבים מבניים - נוקלאוטידים. ישנם 5 סוגי נוקלאוטידים - תימין (T), אדנוזין (A), גואנין (G), ציטוזין (C) ואורציל (U). נוקלאוטידים מסודרים בזה אחר זה ברצף אינדיבידואלי קפדני, ויוצרים גנים. גן אחד עשוי להיות מורכב מ-20-200 נוקלאוטידים כאלה. לדוגמה, הגן המקודד לייצור אינסולין הוא באורך 60 זוגות בסיסים.

לנוקלאוטידים יש תכונה של השלמה. זה אומר שממול לאדנין (A) בגדיל אחד של DNA יש תמיד תימין (T) בגדיל השני, וממול גואנין (G) - ציטוזין (C). באופן סכמטי נראה כך:
G - C
T - א
א - ת
תכונה זו של השלמה היא המפתח עבור PCR.

בנוסף ל-DNA, ל-RNA יש מבנה זהה - חומצה ריבונוקלאית, השונה מה-DNA בכך שהיא משתמשת באורציל במקום בטימין. RNA - הוא שומר המידע הגנטי בנגיפים מסוימים, הנקראים רטרו-וירוסים (לדוגמה, HIV).

מולקולות DNA ו-RNA יכולות "להתרבות" (תכונה זו משמשת ל-PCR). זה קורה באופן הבא: שני גדילים של DNA או RNA מתרחקים זה מזה לצדדים, על כל חוט יושב אנזים מיוחד שמסנתז שרשרת חדשה. הסינתזה מתנהלת על פי עקרון ההשלמה, כלומר אם נוקלאוטיד A נמצא בשרשרת ה-DNA המקורית, אז T יהיה בשרשרת המסונתזת החדשה, אם G - אז C וכו'. לאנזים ה"בונה" המיוחד הזה צריך "זרע" - רצף של 5-15 נוקלאוטידים - כדי להתחיל סינתזה. "זרע" זה מוגדר עבור כל גן (גן לכלמידיה, מיקופלזמות, וירוסים) בניסוי.

אז, כל מחזור PCR מורכב משלושה שלבים. בשלב הראשון מתרחשת מה שנקרא התנתקות של ה-DNA – כלומר, הפרדה של שני גדילי ה-DNA המחוברים זה לזה. בשני, ה"זרע" מחובר לקטע של גדיל ה-DNA. ולבסוף, התארכותם של גדילי ה-DNA הללו, המופקת על ידי האנזים ה"בונה". נכון לעכשיו, כל זה תהליך קשהממשיך במבחנה אחת ומורכב ממחזורים חוזרים ונשנים של רבייה של ה-DNA שנקבע על מנת להשיג מספר רב של עותקים, שאותם ניתן לזהות בשיטות קונבנציונליות. כלומר, מגדיל אחד של DNA, אנו מקבלים מאות או אלפים.

שלבי מחקר PCR

איסוף חומר ביולוגי למחקר

חומרים ביולוגיים שונים משמשים כדגימה: דם ומרכיביו, שתן, רוק, ריריות, נוזל מוחי, הפרשות משטחי פצע, תוכן של חללי גוף. כל הדגימות הביולוגיות נאספות עם מכשירים חד פעמיים, והחומר שנאסף מונח בצינורות פלסטיק סטריליים או מונח על מדיית תרבית, ולאחר מכן הובלה למעבדה.

את הריאגנטים הדרושים מוסיפים לדגימות שנלקחו ומניחים בתרמוסטט הניתן לתכנות - מחזור תרמי (מגבר). במחזור, מחזור ה-PCR חוזר 30-50 פעמים, המורכב משלושה שלבים (דנטורציה, חישול והתארכות). מה זה אומר? בואו נשקול ביתר פירוט.

שלבים של תגובת PCR מיידית, העתקה של חומר גנטי

אנישלב PCR - הכנת חומר גנטי להעתקה.
מתרחש בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, בעוד שגדילי ה-DNA מנותקים, ו"זרעים" יכולים לשבת עליהם.

"זרעים" מיוצרים באופן תעשייתי על ידי איגודי מחקר וייצור שונים, ומעבדות קונות מוכנות. יחד עם זאת, ה"זרע" לגילוי, למשל, כלמידיה, פועל רק לגבי כלמידיה וכו'. לפיכך, אם חומר ביולוגי נבדק עבור נוכחות של זיהום כלמידיה, אז "זרע" לכלמידיה מונח בתערובת התגובה; אם בודקים את החומר הביולוגי עבור נגיף אפשטיין-בר, אז ה"זרע" לנגיף אפשטיין-בר.

IIשלב - שילוב החומר הגנטי של הגורם הזיהומי וה"זרע".
אם יש DNA של הנגיף או החיידק שיש לקבוע, ה"זרע" יושב על ה-DNA הזה. תהליך הוספת פריימר זה הוא השלב השני של ה-PCR. שלב זה מתרחש בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס.

IIIשלב - העתקת החומר הגנטי של הגורם הזיהומי.
זהו תהליך של התארכות או רבייה בפועל של חומר גנטי, המתרחש ב-72 מעלות צלזיוס. בונה אנזים מתקרב ל"זרעים" ומסנתז גדיל חדש של DNA. עם סיום הסינתזה של גדיל DNA חדש, מסתיים גם מחזור ה-PCR. כלומר, במחזור PCR אחד, כמות החומר הגנטי מכפילה את עצמה. לדוגמה, בדגימה הראשונית היו 100 מולקולות DNA של נגיף, לאחר מחזור ה-PCR הראשון כבר יהיו בדגימה 200 מולקולות DNA של הנגיף שנבדק. מחזור אחד נמשך 2-3 דקות.

על מנת לייצר מספיק חומר גנטי לזיהוי, מבוצעים בדרך כלל 30-50 מחזורי PCR, הנמשכים 2-3 שעות.

שלב הזיהוי של החומר הגנטי המתפשט

ה-PCR עצמו מסתיים כאן ואז מגיע שלב הזיהוי המשמעותי לא פחות. לזיהוי, נעשה שימוש באלקטרופורזה או שכותרתו "זרעים". בעת שימוש באלקטרופורזה, גדילי ה-DNA המתקבלים מופרדים לפי גודל, ונוכחותם של שברי DNA באורכים שונים מעידה על תוצאה חיובית של הניתוח (כלומר, נוכחות של וירוס, חיידק מסוים וכו'). כאשר משתמשים ב"זרעים" המסומנים, מתווסף כרומוגן (צבע) לתוצר הסופי של התגובה, וכתוצאה מכך התגובה האנזימטית מלווה ביצירת צבע. התפתחות של צבע מעידה ישירות על כך שווירוס או חומר שניתן לזהות אחר נמצא בדגימה המקורית.

עד היום, באמצעות התווית "זרעים", וכן תוכנות מתאימות, ניתן "לקרוא" מיד את תוצאות ה-PCR. זהו מה שנקרא PCR בזמן אמת.

מדוע אבחון PCR חשוב כל כך?

אחד היתרונות המשמעותיים של שיטת PCR הוא הרגישות הגבוהה שלה - מ-95 עד 100%. עם זאת, יתרונות אלה חייבים להתבסס על שמירה הכרחית על התנאים הבאים:

1. דגימה נכונה, הובלה של חומר ביולוגי;
2. זמינות של מכשירים סטריליים חד פעמיים, מעבדות מיוחדות וצוות מיומן;
3. הקפדה על המתודולוגיה והסטריליות במהלך הניתוח

הרגישות משתנה עבור חיידקים שונים שזוהו. כך, למשל, הרגישות של שיטת ה-PCR לאיתור נגיף ההפטיטיס C היא 97-98%, הרגישות לאיתור ureaplasma היא 99-100%.

היכולות הגלומות בניתוח PCR מאפשרות לך להגיע לספציפיות אנליטית ללא תחרות. המשמעות היא זיהוי בדיוק את המיקרואורגניזם שחיפשו, ולא מיקרואורגניזם דומה או קרוב.
רגישות אבחנתיתוהספציפיות של שיטת ה-PCR, עולים לרוב על אלו של שיטת התרבית, המכונה "תקן הזהב" לאיתור מחלות זיהומיות. בהתחשב במשך הגידול של התרבית (ממספר ימים עד מספר שבועות), היתרון של שיטת ה-PCR מתגלה.

PCR באבחון זיהומים
היתרונות של שיטת ה-PCR (רגישות וסגוליות) קובעים מגוון רחב של יישומים ברפואה המודרנית.
תחומי היישום העיקריים של אבחון PCR:

1. אבחון של מחלות זיהומיות חריפות וכרוניות של לוקליזציה שונות
2. מעקב אחר יעילות הטיפול
3. בירור סוג הפתוגן

PCR משמש במיילדות, גינקולוגיה, ילודים, רפואת ילדים, אורולוגיה, ונרולוגיה, נפרולוגיה, מרפאת מחלות זיהומיות, רפואת עיניים, נוירולוגיה, פטיסיופולמונולוגיה וכו'.

השימוש באבחון PCR מתבצע בשילוב עם שיטות מחקר אחרות (ELISA, PIF, RIF וכו'). שילובם וכדאיותם נקבעים על ידי הרופא המטפל.

גורמים זיהומיים שזוהו באמצעות PCR

וירוסים:

1. רטרו-וירוס HIV-1 ו-HIV-2
2. וירוסים הרפטיים
3. נגיף הרפס סימפלקססוגים 1 ו-2

לאחרונה, אמין, רגיש מאוד ו שיטה מהירהאבחון של מחלות זיהומיות שונות של בני אדם. שיטה זו נקראת "ניתוח PCR". מה זה, מה המהות שלו, אילו מיקרואורגניזמים זה יכול לחשוף ואיך לקחת את זה נכון, נספר במאמר שלנו.

היסטוריית גילוי

כמו כן, נעשה שימוש בשיטות PCR באבחון סרטן.

יתרונות השיטה

לאבחון PCR מספר יתרונות:

1. רגישות גבוהה. אפילו בנוכחות רק כמה מולקולות של DNA של מיקרואורגניזם, ניתוח PCR קובע את נוכחות הזיהום. השיטה תסייע במחלות כרוניות ומופיעות בסמויה. לעתים קרובות במקרים כאלה, המיקרואורגניזם אינו תרבותי אחרת.
2. כל חומר מתאים למחקר, למשל, רוק, דם, הפרשות איברי המין, שיער, תאי אפיתל. הנפוץ ביותר הוא בדיקת דם ומריחה אורוגנית ל-PCR.

   

3. טיפוח ארוך טווח של יבולים אינו נדרש. תהליך האבחון האוטומטי מאפשר לקבל את תוצאות המחקר לאחר 4-5 שעות.
4. השיטה אמינה כמעט ב-100%. רק מקרים בודדים של תוצאות שליליות כוזבות נרשמו.
5. אפשרות לזהות מספר סוגי פתוגנים מדגימת חומר אחת. זה לא רק מזרז את תהליך אבחון המחלה, אלא גם מפחית משמעותית את עלויות החומר. לעתים קרובות הרופא רושם ניתוח PCR מקיף. מחיר הבדיקה, המורכבת מקביעת שישה פתוגנים, הוא כ-1,500 רובל.

על מנת שהתוצאות יהיו אמינות במהלך מחקר ה-PCR, יש צורך לעבור את הניתוח, בהתאם להמלצות להכנה מקדימה לאבחון:

1. לפני תרומת רוק, יש להימנע מאכילה ונטילת תרופות 4 שעות לפני נטילת החומר. מיד לפני ההליך, שטפו את הפה במים רתוחים.
2. יש להקפיד על הכללים לעיל גם בעת נטילת דגימה מהמשטח הפנימי של הלחי. לאחר השטיפה, מומלץ לבצע עיסוי עור קל להדגשת סוד הבלוטה.
3. בדרך כלל אוספים שתן בבית. כדי לעשות זאת, אתה צריך לנהל שירותים יסודי של איברי המין. אסוף 50-60 מ"ל שתן במיכל פלסטיק סטרילי. כדי להבטיח את טוהר החומר, מומלץ לנשים להחדיר טמפון לנרתיק ולגברים למשוך את קפל העור עד כמה שניתן. אתה לא יכול לקחת את החומר במהלך זרימת הווסת.
4. כדי לתרום זרע יש להימנע מקיום יחסי מין במשך 3 ימים לפני איסוף החומר. הרופאים ממליצים גם לא לבקר בסאונה ולעשות אמבטיה חמה, שתיית אלכוהול ואוכל חריף. 3 שעות לפני הניתוח, עליך להימנע ממתן שתן.
5. ללידה, למשל, אם מבוצעת בדיקת PCR לכלמידיה, מומלץ לנשים וגם לגברים לנוח מינית למשך 3 ימים. אין ליטול תרופות אנטיבקטריאליות שבועיים לפני הניתוח. במשך שבוע, אתה צריך להפסיק להשתמש ג'לים אינטימיים, משחות, נרות נרתיקיות, שטיפה. 3 שעות לפני הבדיקה יש להימנע ממתן שתן. במהלך הווסת, דגימת החומר לא מתבצעת, רק 3 ימים לאחר הפסקת הפרשת הדם, אתה יכול לקחת כתם אורוגניטלי.

PCR במהלך ההריון

במהלך תקופת הציפייה לתינוק, מחלות זיהומיות רבות, המועברות במגע מיני, מסוכנות ביותר עבור התפתחות תקינהעוּבָּר. מחלות מין יכולות לעורר פיגור בגדילה תוך רחמית, הפלה או לידה מוקדמת, מומים מולדים של הילד. לכן, חשוב ביותר ללכת אליו דייטים מוקדמיםבדיקת הריון באמצעות PCR. יש צורך לעבור את הניתוח בעת ההרשמה - עד 12 שבועות.



החומר נלקח מתעלת צוואר הרחם באמצעות מברשת מיוחדת. ההליך אינו כואב ואינו מהווה סכנה לתינוק. בדרך כלל במהלך ההריון, ניתוח מתבצע עבור כלמידיה בשיטת PCR, כמו גם עבור ureaplasmosis, mycoplasmosis, cytomegalovirus, הרפס, papillomavirus. קומפלקס כזה של בדיקות נקרא PCR-6.

PCR לאבחון HIV

בשל העובדה שהשיטה רגישה מאוד לשינויים בגוף ולתנאי האבחון, גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה. לכן, ניתוח PCR לזיהום ב-HIV אינו שיטה אמינה, היעילות שלה היא 96-98%. ב-2-4% הנותרים מהמקרים, הבדיקה נותנת תוצאות חיוביות שגויות.

אבל במצבים מסוימים, אי אפשר להסתדר בלי אבחון PCR של HIV. זה ניתן בדרך כלל לאנשים עם תוצאת ELISA שגויה-שלילית. אינדיקטורים כאלה מצביעים על כך שאדם עדיין לא פיתח נוגדנים לנגיף ולא ניתן לזהות אותם ללא עלייה מרובה במספר. זה בדיוק מה שניתן להשיג בביצוע בדיקת דם בשיטת PCR.

אבחון כזה נחוץ גם לילדים בשנה הראשונה לחייהם שנולדו מאם נשאית HIV. השיטה היא הדרך היחידהקביעה מהימנה של מצב הילד.

PCR לאבחון של הפטיטיס

שיטת תגובת שרשרת הפולימראז מאפשרת לזהות את ה-DNA של וירוס הפטיטיס A,B,C הרבה לפני היווצרות נוגדנים לזיהום או הופעת תסמיני המחלה. ניתוח PCR עבור הפטיטיס C יעיל במיוחד, שכן ב-85% מהמקרים מחלה זו היא אסימפטומטית וללא טיפול בזמן, עוברת לשלב הכרוני.



גילוי בזמן של הפתוגן יעזור למנוע סיבוכים וטיפול ארוך טווח.

בדיקת PCR מקיפה

ניתוח PCR מקיף: בדיקה בשיטת תגובת שרשרת פולימרית הכוללת קביעת מספר סוגי זיהומים בו זמנית: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, cytomegalovirus, herpes type 1 and 2, gonorrhea, papillomavirus. המחיר של אבחון כזה נע בין 2000 ל 3500 רובל. בהתאם למרפאה, החומרים והציוד המשמשים, וכן בסוג הניתוח: איכותי או כמותי. מה שצריך במקרה שלך - הרופא יחליט. במקרים מסוימים, זה מספיק רק כדי לקבוע את נוכחות הפתוגן, באחרים, למשל, עם זיהום HIV, טיטר כמותי ממלא תפקיד חשוב. כאשר מאבחנים את כל הפתוגנים הנ"ל, הבדיקה נקראת "ניתוח PCR-12".

פענוח תוצאות הניתוח

פענוח ניתוח ה-PCR אינו קשה. יש רק 2 סולמות של המחוון - " תוצאה חיובית' ו'תוצאה שלילית'. כאשר מתגלה פתוגן, הרופאים יכולים לאשר את נוכחות המחלה בוודאות של 99% ולהתחיל לטפל בחולה. עם שיטה כמותית לקביעת זיהום, העמודה המתאימה תציין את האינדיקטור המספרי של חיידקים שזוהו. רק רופא יכול לקבוע את מידת המחלה ולרשום את הטיפול הדרוש.



במקרים מסוימים, למשל, בעת קביעת זיהום HIV על ידי PCR, עם תוצאה שלילית, יש צורך לבצע בדיקות נוספות כדי לאשר את האינדיקטורים שהושגו.

לאן לקחת את הניתוח?

היכן לעשות ניתוח PCR: במרפאה ציבורית או במעבדה פרטית? למרבה הצער, במוסדות רפואיים עירוניים, הציוד והשיטות לרוב מיושנים. לכן, עדיף לתת עדיפות למעבדות פרטיות עם ציוד מודרני וכוח אדם מוסמך מאוד. בנוסף, בקליניקה פרטית תקבלו תוצאות הרבה יותר מהר.

במוסקבה, מעבדות פרטיות רבות מציעות ניתוח PCR לזיהומים שונים. לדוגמה, במרפאות כמו Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, מתבצע ניתוח PCR. מחיר הבדיקה הוא מ 200 רובל. לזיהוי פתוגן בודד.

ניתן להסיק כי אבחון מחלות זיהומיות באמצעות PCR ברוב המקרים מהווה דרך מהירה ואמינה לזיהוי הפתוגן בגוף בשלבי ההדבקה המוקדמים. אבל עדיין, במקרים מסוימים, כדאי לבחור שיטות אבחון אחרות. רק מומחה יכול לקבוע את הצורך במחקר כזה. גם פענוח ניתוח ה-PCR דורש גישה מקצועית. עקוב אחר הוראות הרופא שלך ואל תעשה בדיקות שאינך צריך.