PCR-analyysin (PCR-diagnostiikka) suorittaminen alkaa aineiston keräämisellä gynekologin, urologin tai dermatovenerologin tutkittavaksi. Myöhemmin saatujen tulosten laadun ja luotettavuuden takaa Euromedprestige Medical Centerin lääkäreiden korkein pätevyys ja laaja kokemus, jotka noudattavat kaikkia tarvittavia sääntöjä. PCR-analyysi: täydellinen steriiliys, yksinomaan kertakäyttöisten materiaalien käyttö.

Harjasta kerätty materiaali asetetaan säiliöön, jossa on suolaliuosta. Näytteenoton jälkeen näytteet tulee toimittaa PCR-laboratorioon mahdollisimman pian.

PCR-analyysi laboratoriossa tapahtuu kolmessa vaiheessa:

1. DNA:n eristäminen
2. DNA-fragmenttien monistaminen
3. DNA-monistustuotteiden havaitseminen

DNA:n erottaminen on PCR-diagnostiikan alkuvaihe, jonka ydin on seuraava: lääkäri ottaa potilaalta tutkimusaineiston ja käsittelee sen erityisellä tavalla. Prosessoinnin aikana DNA:n kaksoiskierre jakautuu erillisiin säikeisiin. Potilaan materiaaliin lisätään erityistä nestettä, joka liuottaa orgaaniset aineet, jotka häiritsevät reaktion "puhtautta". Tämä poistaa lipidit, aminohapot, peptidit, hiilihydraatit, proteiinit ja polysakkaridit. Tuloksena on DNA tai RNA.

PCR-menetelmän periaate on uusien DNA- tai RNA-infektioiden "rakentaminen". Tätä ei voida tehdä ilman solumateriaalin poistamista.

DNA:n erottamiseen käytetty aika riippuu infektion aiheuttajasta ja PCR-testaukseen käytetyn materiaalin tyypistä. Esimerkiksi veren valmistaminen seuraavaa vaihetta varten kestää 1,5-2 tuntia.

0Matriisi ( => Analyysit) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

DNA:n monistus

DNA-diagnostiikan seuraavan vaiheen - DNA:n monistamisen - suorittamiseksi lääkärit käyttävät niin kutsuttuja DNA-matriiseja - infektioiden DNA-molekyylejä, joihin myöhemmin tapahtuu DNA:n "kloonaus". On jo mainittu, että infektion täydellisen DNA:n läsnäolo ei ole välttämätöntä, tähän vaiheeseen riittää pieni pala DNA-molekyyliä, joka on ainutlaatuinen tälle mikrobille (infektio).

DNA-monistuksen ytimessä ja vastaavasti koko PCR-reaktion periaatteen ytimessä on luonnollinen DNA:n valmistumisprosessi kaikille eläville eliöille - DNA:n replikaatio, joka suoritetaan kaksinkertaistamalla yksi DNA-ketju.

Yhdestä DNA-fragmentista alkaen laboratoriolääkäri kopioi sen ja lisää kopioiden määrää ketjureaktiossa: ensimmäisen syklin jälkeen sinulla on jo 2 fragmenttia, toisen syklin jälkeen - 4, kolmannen jälkeen - 8, neljännen jälkeen. - 16, sitten 32 , 64, 128, 256... Jokaisella jaksolla kopioiden määrä kaksinkertaistuu, ja kahdenkymmenen jakson jälkeen luku nousee miljooniin ja kolmenkymmenen jälkeen miljardeihin. Jakso kestää muutaman minuutin ja se pienennetään tiettyyn lämpötilajärjestelmän muutokseen hyvin pienessä kemiallisessa reaktorissa. Täällä liuoksessa on riittävä määrä synteesin kaikki tarvittavat komponentit, ensinnäkin nukleotidit A, G, T ja C, ja myös hienoja valmistavia kemiallisia operaatioita tehtiin niin, että jokaisesta valmiista DNA:sta tehtiin heti tarkka kopio. segmentti, sitten tästä kopiosta - jälleen kopio, tämä on haarautunut ketjureaktio.

Kiinnittämällä DNA-ketjuun alukkeita - keinotekoisesti syntetisoituja DNA:n "palasia" (nukleotidiparit), jotka ovat samanlaisia ​​kuin mikrobien DNA (infektio) - muodostuu kaksi lyhyttä, kahdesta DNA-osien ketjusta koostuvaa heliksiä, jotka ovat välttämättömiä synteesin kannalta. tulevaisuuden DNA:sta.

Uuden ketjun synteesi tapahtuu saattamalla molemmat DNA-juosteet valmiiksi. Monistusprosessi tapahtuu tietyn kohdan - DNA-polymeraasin - avulla, joka antoi nimen laboratoriomenetelmälle. Polymeraasi toimii katalyyttinä reaktiolle ja valvoo nukleotidiemästen peräkkäistä kiinnittymistä kasvavaan uuteen DNA-juosteeseen.

Siten DNA:n monistuminen on moninkertaista lisäystä DNA-kopioiden lukumäärässä, jotka ovat spesifisiä, ts. vain tietylle organismille ominaisia. Koko DNA-ketjua ei tarvitse suorittaa loppuun, jotta infektion aiheuttaja voidaan nähdä. Tarvitaan vain alue, joka on ominaista tälle bakteerille yksilönä.

5360 hieroa. Kattavan ohjelman hinta gastroenterologin kanssa

25% ALENNUS SYDÄLÖOGIN VASTASSA

- 25%ensisijainen
Lääkärin käynti
viikonloppu terapeutti

5 160 hieroa. 5 420 ruplan sijasta. Miesten tutkiminen urologisten infektioiden varalta

ALLERGOLOGIA 5 120 hieroa. 5 590 ruplan sijasta.

Kaikki moninkertaisesti toistuvat vahvistusvaiheet tapahtuvat eri lämpötiloissa. PCR-analyysiin käytetään erityisesti ohjelmoitavaa laitteistoa - PCR - termostaattia tai vahvistinta, joka muuttaa automaattisesti lämpötiloja. Monistaminen suoritetaan ennalta määrätyn ohjelman mukaisesti, joka vastaa havaittavan infektion tyyppiä. Ohjelmasta ja havaittavan infektion tyypistä riippuen automaattinen PCR-prosessi kestää 2–3 tuntia.

PCR-diagnostiikassa analyysin suorittavan laborantin pätevyys on tärkeä rooli, siitä riippuu PCR-laitteiston oikea asetus ja tulosten tulkinta. Euromedprestige Medical Centerin lääkäreillä on pitkä kokemus DNA-diagnostiikan suorittamisesta, mikä varmistaa tutkimuksen tulosten luotettavuuden ja positiivisen onnistumisen hoidossa. tarttuvat taudit. Ottaa PCR-testejä ja suorittaa täydellinen diagnostiikka ja tartuntatautien hoito meillä terveyskeskus Euromedprestige.

Monistustuotteiden havaitsemisen aikana tuloksena oleva monistustuotteiden seos erotetaan. Seokseen lisätään erikoisliuoksia, jotka antavat DNA-fragmenteille kyvyn fluoresoida - heijastaa oranssinpunaisia ​​valoisia raitoja. Tuloksena oleva hehku osoittaa virusten, mikrobien tai bakteerien DNA:n läsnäolon potilaasta PCR-analyysiä varten otetussa materiaalissa.

SEI HPE "Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia

nimetty Yasenetskyn liittovaltion terveys- ja sosiaalisen kehityksen viraston mukaan »

Lääketieteellisen genetiikan ja kliinisen neurofysiologian laitos, IPO

MENETELMÄN PÄÄPERIAATTEET

POLYMERAASI KETJUREAKTIO

Toolkit 3-4 kurssin opiskelijoille

yleislääketieteen erikoisaloilla (060101) ja

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Polymeraasiketjureaktiomenetelmän perusperiaatteet. Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja lastenlääketieteen (060103) erikoisalojen 3-4 kurssin opiskelijoille. - Krasnojarsk: Kustantaja GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42s.

Menetelmäkäsikirja on täysin valtion standardin (2000) vaatimusten mukainen ja heijastaa pääasiallisia näkökohtia moderni menetelmä diagnostiikka perinnölliset sairaudet ihminen - polymeraasiketjureaktion menetelmä, johon opetusmateriaali on mukautettu koulutusteknologiat ottaen huomioon koulutuksen erityispiirteet lääketieteellisten ja lastenlääketieteellisten tiedekuntien 3-4 kurssilla.

Arvostelijat: Lääketieteellisen genetiikan osaston päällikkö, valtion korkeakouluoppilaitos

"liittovaltion terveysviraston Novosibirskin osavaltion lääketieteellinen yliopisto ja sosiaalinen kehitys”, lääketieteen tohtori, professori;

DNA kopiointi

Tämän menetelmän tutkimuskohteena on deoksiribonukleiinihappo (DNA). DNA on geneettisen tiedon universaali kantaja kaikissa maan päällä olevissa organismeissa (lukuun ottamatta RNA:ta sisältäviä mikro-organismeja). DNA on kaksoisjuoste, joka on kiertynyt kierteeksi. Jokainen juoste koostuu sarjaan kytketyistä nukleotideista. DNA-säikeillä on päinvastainen suunta: yhden juosteen 5'-pää vastaa toisen juosteen 3'-päätä. Ainutlaatuinen omaisuus DNA on sen kyky monistaa itseään. Tätä prosessia kutsutaan replikointi. DNA-molekyylin replikaatio tapahtuu interfaasin synteettisen ajanjakson aikana. Kumpikin "emo"-molekyylin kahdesta ketjusta toimii mallina "tyttärelle". Replikaation jälkeen äskettäin syntetisoitu DNA-molekyyli sisältää yhden "äidin" juosteen ja toisen - "tytär", juuri syntetisoitu (puolikonservatiivinen menetelmä). varten matriisisynteesi uutta DNA-molekyyliä varten vanha molekyyli on poistettava spiraalista ja venytettävä. Replikaatio alkaa useista kohdista DNA-molekyylissä. DNA-molekyylin osaa replikaation alusta toisen replikaation alkuun kutsutaan replikoni.

Replikoinnin aloitus on aktivoitu alukkeet(siemenet), jotka koostuvat 100-200 emäsparista. DNA-helikaasientsyymi purkaa ja erottaa emo-DNA-kierteen kahdeksi juosteeksi, joihin komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti DNA-polymeraasientsyymin osallistuessa kootaan "tytär"-DNA-säikeitä. Jotta entsyymi voisi aloittaa toimintansa, tarvitaan aloituslohko - pieni alkuperäinen kaksijuosteinen fragmentti. Aloituslohko muodostuu, kun aluke on vuorovaikutuksessa emo-DNA:n vastaavan juosteen komplementaarisen alueen kanssa. Jokaisessa replikonissa DNA-polymeraasi voi liikkua "emäjuostetta" pitkin vain yhteen suuntaan (5`=>3`).

Johtavassa juosteessa replikonin purkauduttua "tytärjuoste" kasvaa vähitellen jatkuvasti. Jäljellä olevalla juosteella tytärjuoste syntetisoituu myös suunnassa (5`=>3`), mutta erillisissä fragmenteissa replikonin kiertyessä.

Siten "tytär"-säikeiden komplementaaristen nukleotidien kiinnittyminen tapahtuu vastakkaisiin suuntiin (antirinnakkais). Replikaatio kaikissa replikoneissa tapahtuu samanaikaisesti. Eri replikoneissa syntetisoidut "tytär"-juosteiden fragmentit ja osat ligoidaan yhdeksi juosteeksi entsyymiligaasilla. Replikaatiolle on ominaista puolikonservoituminen, anti-rinnakkaisisuus ja epäjatkuvuus. Solun koko genomi replikoituu kerran yhtä mitoottista sykliä vastaavan ajanjakson aikana. Replikaatioprosessin tuloksena yhdestä DNA-molekyylistä muodostuu kaksi DNA-molekyyliä, joista toinen juoste on peräisin emo-DNA-molekyylistä ja toinen, tytär, syntetisoituu vasta (kuvio 1).

Riisi. 1. Kaavio DNA-molekyylin replikaatiosta.

Siten DNA-replikaatiosykli sisältää kolme päävaihetta:

1. DNA-kierteen purkaminen ja säikeiden hajoaminen (denaturaatio);

2. pohjamaalien kiinnitys;

3. lapsilangan ketjun loppuun saattaminen.

PCR-menetelmän periaate

DNA:n replikaatio muodosti PCR:n perustan. PCR:ssä yllä luetellut prosessit suoritetaan koeputkessa syklisessä tilassa. Siirtyminen reaktiovaiheesta toiseen saavutetaan muuttamalla inkubointiseoksen lämpötilaa. Kun liuos kuumennetaan 93-95 °C:seen, DNA denaturoituu. Seuraavaan vaiheeseen siirtymiseksi - alukkeiden lisäämiseen tai "pariuttamiseen" - inkubointiseos jäähdytetään 50-65 °C:seen. Seuraavaksi seos kuumennetaan 70-72 °C:seen - taq-DNA-polymeraasin optimaaliseen toimintaan - tässä vaiheessa uusi DNA-juoste valmistuu. Sitten sykli toistuu uudelleen. Toisin sanoen PCR-menetelmä on moninkertainen kopiomäärän lisääminen (vahvistusta) DNA-polymeraasientsyymin katalysoima DNA:n spesifinen osa.

Tytär-DNA-juosteiden pidentymisen on tapahduttava samanaikaisesti äidin DNA:n molemmissa juosteissa, joten myös toisen juosteen replikaatio vaatii oman alukkeen. Siten reaktioseokseen lisätään kaksi aluketta: yksi "+"-ketjua varten, toinen "-"-ketjua varten. Yhdistettyään vastakkaiset DNA-molekyylin juosteet alukkeet rajoittuvat siihen osaan, joka myöhemmin kaksinkertaistuu tai monistuu. Tällaisen fragmentin, jota kutsutaan amplikoniksi, pituus on yleensä useita satoja nukleotideja.

PCR-vaiheet

Jokainen vahvistussykli sisältää 3 vaihetta, jotka tapahtuvat eri lämpötilaolosuhteissa (kuvio 2).

· Vaihe 1: DNA:n denaturaatio . Se virtaa 93-95° 30-40 sekunnin ajan.

· Vaihe 2: primer hehkutus . Alukkeen kiinnittyminen tapahtuu komplementaarisesti vastaavien sekvenssien kanssa vastakkaisissa DNA-säikeissä tietyn kohdan rajoilla. Jokaisella pohjamaaliparilla on oma hehkutuslämpötilansa, jonka arvot ovat välillä 50-65°C. Hehkutusaika 20-60 sek.

· Vaihe 3: DNA-ketjujen komplementaarinen pidentyminen tapahtuu ketjun 5"-päästä 3"-päähän vastakkaisiin suuntiin, alkaen alukkeen kiinnityskohdista. Materiaalina uusien DNA-ketjujen synteesiin ovat liuokseen lisätyt. Synteesiprosessia katalysoi taq-polymeraasientsyymi ja se tapahtuu 70-72 °C:n lämpötilassa. Synteesiaika - 20-40 sek.

Ensimmäisessä monistussyklissä muodostuneet uudet DNA-juosteet toimivat templaatteina toiselle monistussyklille, jossa muodostuu spesifinen amplikonin DNA-fragmentti (kuvio 3). Seuraavissa amplifikaatiosykleissä amplikonit toimivat mallina uusien ketjujen synteesille.

Siten amplikoneja kerääntyy liuokseen kaavan 2" mukaisesti, jossa n on monistussyklien lukumäärä. Siksi, vaikka alkuperäisessä liuoksessa olisi alun perin vain yksi kaksijuosteinen DNA-molekyyli, noin 108 amplikonimolekyyliä kerääntyy liuokseen 30-40 sykliä Tämä määrä on riittävä tämän fragmentin luotettavaan visuaaliseen havaitsemiseen agaroosigeelielektroforeesilla.

Vahvistusprosessi suoritetaan erityisessä ohjelmoitavassa termostaatissa ( pyöräilijä), joka tietyn ohjelman mukaan muuttaa automaattisesti lämpötiloja vahvistusjaksojen lukumäärän mukaan.

Vahvistamiseen tarvitaan seuraavat komponentit:

· DNA-malli(DNA tai sen osa, joka sisältää halutun spesifisen fragmentin);

· Pohjusteet(synteettiset oligonukleotidit (20-30 nukleotidiparia), jotka ovat komplementaarisia DNA-sekvensseille määritettävän spesifisen fragmentin rajoilla). Spesifisen fragmentin valinnalla ja alukkeiden valinnalla on suuri rooli monistuksen spesifisyydessä, mikä vaikuttaa analyysin laatuun.

· Deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) seos(seos neljästä dNTP:stä, jotka ovat materiaalia uusien komplementaaristen DNA-juosteiden synteesiin 200-500 mikronin ekvivalenttipitoisuuksina)

· EntsyymiTaq-polymeraasi(lämpöstabiili DNA-polymeraasi, katalysoi alukeketjujen pidentymistä lisäämällä peräkkäin nukleotidiemäksiä syntetisoidun DNA:n kasvavaan ketjuun, 2-3 mm).

· puskuriliuos(reaktioväliaine, joka sisältää Mg2+-ioneja, jotka ovat välttämättömiä entsyymiaktiivisuuden ylläpitämiseksi, PH 6,8-7,8).

RNA-virusten genomin spesifisten alueiden määrittämiseksi hankitaan ensin DNA-kopio RNA-templaatista käyttämällä käänteiskopioijareaktiota (RT), jota katalysoi käänteiskopioijaentsyymi (käänteistranskriptaasi).

Riisi. 2. Vahvistus (1. sykli).

Riisi. 3. Vahvistus (2. sykli).

PCR:n pääsovellukset

kliininen lääke:

o infektioiden diagnoosi,

o mutaatioiden havaitseminen, mukaan lukien perinnöllisten sairauksien diagnosointi,

o genotyypitys, mukaan lukien HLA-genotyypitys,

o soluteknologiat

ekologia (tapana seurata ympäristön esineiden ja elintarvikkeiden tilaa ja laatua)

siirtogeenisten organismien (GMO) määritelmä

Henkilöllisyystodistus, isyys, oikeuslääketiede

yleinen ja erikoisbiologia,

Perusperiaatteet

diagnostisten laboratorioiden järjestäminen

Työ PCR-laboratoriossa suoritetaan "terveydenhuoltojärjestelmän terveys- ja epidemiologisten laitosten laboratorioissa (osastoilla, osastoilla) työskentelyn suunnittelua, turvallisuutta, teollisuuden sanitaatiota, epidemian vastaista järjestelmää ja henkilökohtaista hygieniaa koskevien sääntöjen mukaisesti.

DNA-näytteiden kontaminaatio

PCR-diagnostiikan suorittamiseen liittyy menetelmän korkeasta herkkyydestä johtuva ongelma - mahdollisuus saastuminen. Jos pieniä määriä positiivista DNA:ta pääsee reaktioputkeen (spesifiset DNA:n monistustuotteet - amplikonit; DNA-standardi positiivisena kontrollina; kliinisen näytteen positiivinen DNA), johtaa tietyn DNA-fragmentin monistumiseen PCR:n aikana ja sen seurauksena väärien positiivisten tulosten ilmestyminen.

Työn aikana voit tavata kahdenlaisia ​​saasteita:

1. ristiin saastuminen näytteestä näytteeseen (kliinisten näytteiden käsittelyn aikana tai reaktioseosta kaivettaessa), mikä johtaa satunnaisten väärien positiivisten tulosten ilmestymiseen;

2. vahvistustuotteen kontaminaatio(amplikonit), joilla on korkein arvo, koska PCR-prosessin aikana amplikoneja kertyy valtavia määriä ja ne ovat ihanteellisia tuotteita uudelleenvahvistukseen.

Astioiden, automaattisten pipettien ja laboratoriolaitteiden, laboratoriopöytien pinnan tai jopa laboratoriotyöntekijöiden ihon pinnan jäljessä oleva amplikonikontaminaatio johtaa systemaattisten väärien positiivisten tulosten ilmestymiseen. Saastumislähteen määrittäminen voi olla erittäin vaikeaa ja vaatii huomattavan ajan ja rahan investoinnin. Tähän mennessä kertynyt kokemus diagnostiikassa PCR-menetelmää käyttävien laboratorioiden työstä antaa meille mahdollisuuden muotoilla perusvaatimukset tällaisten laboratorioiden organisaatiolle ja itse analyysien suorittamiselle. Näiden vaatimusten noudattaminen eliminoi kontaminaation ja väärien positiivisten tulosten mahdollisuuden.

PCR-analyysin vaiheet

Maantieteellisesti erotettu, sijoittamalla ne erillisiin huoneisiin (kuva 4.5):

· PCR-huone, jossa suoritetaan kliinisten näytteiden käsittely, DNA-uutto, reaktioseoksen valmistelu PCR:ää ja PCR:ää varten (jos olosuhteet ovat saatavilla, myös kaksi viimeistä vaihetta suositellaan suoritettavaksi erillisessä lisähuoneessa). Näissä tiloissa on kiellettyä tehdä kaikenlaista muuta työtä tutkituilla aineilla, joiden PCR-diagnostiikka suoritetaan tässä laboratoriossa.

· Post-PCR-huone, jossa amplifikaatiotuotteiden havaitseminen suoritetaan. Tässä huoneessa voidaan käyttää muita tunnistusmenetelmiä. On toivottavaa sijoittaa tila amplifikaatiotuotteiden havaitsemista varten mahdollisimman kauas PCR:tä edeltävistä huoneista.

Työhuoneet on varustettu ultraviolettilampuilla, joiden suurin säteily on alueella 260 nm (tyyppi DB-60) nopeudella 2,5 W / 1 m3. Lamput on sijoitettu siten, että työpöytien, laitteiden ja materiaalien pinnat, joihin käyttäjä joutuu kosketuksiin PCR-analyysin aikana, altistuvat suoralle säteilylle. Säteilytys suoritetaan 1 tunnin sisällä ennen työn aloittamista ja 1 tunnin kuluessa työn päättymisestä.

Laboratoriolääkärit työskentelevät erityisissä laboratoriovaatteissa, jotka vaihdetaan siirryttäessä huoneesta toiseen, ja kertakäyttökäsineissä. Vaatteiden käsittely eri huoneista suoritetaan erikseen. Eri työntekijät työskentelevät PCR-analyysin eri vaiheissa.

Työssä käytetään erillisiä annostelijasarjoja, muovi- ja lasitavaroita, laboratoriolaitteita, kylpytakeita ja käsineitä, jotka on suunniteltu eri analyysivaiheisiin ja joita ei voida siirtää huoneesta toiseen. Jokaisen huoneen laitteet, materiaalit ja inventaario on merkitty vastaavasti.

Kaikki työvaiheet suoritetaan vain käyttämällä kertakäyttöisiä tarvikkeita: automaattipipettien kärjet, koeputket, käsineet jne. Muista vaihtaa kärjet, kun siirryt näytteestä näytteeseen. On tarpeen käyttää aerosolisulkusuodattimella varustettuja kärkiä, jotta liuoksen mikropisaroita ei pääse pipettiin. Käytetyt putket ja kärjet hävitetään erityisiin tai sisältäviin astioihin desinfioiva liuos. Kliiniset näytteet säilytetään erillään reagensseista.

Työpaikan käsittelyä ja siivoamista varten jokaisessa huoneessa on vanupuupuikkoja (lautasliina), pinsettejä, desinfiointi- ja inaktivointiliuoksia.

PCR-diagnostiikkalaboratoriossa ei voida tehdä työtä, joka liittyy tässä laboratoriossa diagnosoitujen patogeenien DNA-sekvenssejä tai geenifragmentteja sisältävien rekombinanttiplasmidien tuotantoon (kloonaukseen) ja eristämiseen.

Kliinisen materiaalin kokoelma

PCR:ssä tutkittava materiaali voi olla epiteelisolujen raapimista, verta, plasmaa, seerumia, keuhkopussin ja selkäydinnestettä, virtsaa, ysköstä, limaa ja muita biologisia eritteitä, biopsianäytteitä.

Näytteenotto materiaalista suoritetaan vastaavan profiilin hoitohuoneen olosuhteissa. Näytteenoton jälkeen näytteet tulee viedä PCR-diagnostiikkalaboratorioon mahdollisimman pian.

Näytteenotto on suoritettava steriileillä, mieluiten kertakäyttöisillä instrumenteilla vain kertakäyttöisissä steriileissä muoviputkissa tai lasiputkissa, esikäsitelty tunnin ajan kromiseoksella, pestävä perusteellisesti tislatulla vedellä ja kalsinoitu uunissa 150 °C:n lämpötilassa. 1 tunnin ajan.

Havaintoalue (toinen kerros tai toinen rakennus).

Riisi. 4. PCR-laboratoriolaite, jossa havaitaan elektroforeesilla.

Havaintoalue (eri kerros tai rakennus)

Riisi. 5. PCR-laboratoriolaite fluoresenssitunnistimella (kvantitatiivinen analyysi).

Riisi. 6. DNA:n erotushuone. Kuvassa on pöytälaatikko, jossa on bakterisidinen lamppu.

Riisi. 7. vahvistushuone.

Riisi. 8. Havaintohuone.

Riisi. 9. Verinäytteet perinnöllisten sairauksien DNA-diagnostiikkaan.

Näytteiden varastointi ja kuljetus

Perinnöllisten sairauksien diagnosointia varten verinäytteitä säilytetään erikoispaperilomakkeilla tai epindorfeissa (muovisissa koeputkissa) jäädytettyinä pitkään (kuva 9).

Tartuntatautien diagnosointia varten näytteitä pidetään huoneenlämmössä enintään 2 tuntia. Jos tarvitaan pidempää säilytystä, näytteet voidaan laittaa jääkaappiin 2-8°C lämpötilaan enintään 24 tunniksi. Pidempi varastointi (jopa 2 viikkoa) on hyväksyttävää pakastettuna pakastimessa -20°C:n lämpötilassa. Näytteiden toistuva jäädyttäminen ja sulattaminen ei ole sallittua.

Jos PCR-diagnostiikkalaboratorio ja näytteenottotila on alueellisesti erotettu toisistaan, näytteet on kuljetettava termosissa tai lämpösäiliöissä näytteiden säilytyssääntöjen ja tartuntamateriaalien kuljetussääntöjen mukaisesti.

DNA:n erottaminen näytteistä

Kiinteäfaasisorptiomenetelmä, jossa lisätään guanidiiniliuosta sisältävää hajottavaa ainetta, DNA:n sorptio sorbentille, toistuva pesu ja DNA:n resorptio puskuriliuoksella, on yleistynyt. Seerumin, plasman tai kokoveren käsittelyssä käytetään yleensä fenoliuuttomenetelmää. Menetelmä sisältää proteiininpoiston fenoli/kloroformilla, mitä seuraa DNA:n (tai RNA:n) saostaminen etanolilla tai isopropanolilla. Käsittely suoritetaan Eppendor P -tyyppisissä mikrosentrifugikoeputkissa, joiden tilavuus on 1,5 ml. Käsittelyaika on 1,5-2 tuntia (kuva 10).

Riisi. 10. DNA:n eristäminen.

PCR:n suorittaminen

Tietty määrä näytettä käsitellystä kliinisestä näytteestä siirretään erityiseen Eppendorf-tyyppiseen mikrosentrifugiputkeen, jonka tilavuus on 0,2 tai 0,5 ml, johon lisätään monistusseos, joka koostuu vedestä, PCR-puskurista, dNTP-liuoksesta, alukeliuoksesta ja liuoksesta. sama putki Taq-polymeraasi (lisätään viimeisenä seokseen) Tyypillisesti reaktioseoksen tilavuus on 25 µl Sitten jokaiseen putkeen lisätään yksi tippa mineraaliöljyä estämään reaktioseoksen haihtuminen monistuksen aikana Putket siirretään ohjelmoitava termostaatti (vahvistin), jossa vahvistus suoritetaan automaattitilassa tietyn ohjelman mukaan (kuva 11).

Riisi. yksitoista. vahvistin" Lämpöpyöräilijä ».

Reaktioaika on annetusta ohjelmasta riippuen 2-3 tuntia. Rinnakkain koenäytteiden kanssa sijoitetaan kontrollinäytteitä: positiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen näytteen materiaalin sijaan otetaan käyttöön tutkittavan geenin kontrolli-DNA-valmiste. Negatiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen materiaalin tai DNA-valmisteen sijasta lisätään sopiva määrä deionisoitua vettä tai uutetta, joka ei sisällä tutkittua DNA:ta. Negatiivinen kontrolli on tarpeen reaktion komponenttien tarkistamiseksi, ettei niissä ole DNA:ta kontaminaatiosta johtuen, ja väärien positiivisten tulosten sulkemiseksi pois.

Tulosten rekisteröinti

Monistettu spesifinen DNA-fragmentti havaitaan agaroosigeelielektroforeesilla etidiumbromidin läsnä ollessa. Etidiumbromidi muodostaa DNA-fragmenttien kanssa stabiilin interstitiaalisen yhdisteen, joka näkyy kirkkaina vyöhykkeinä, kun geeliä säteilytetään UV-säteilyllä, jonka aallonpituus on 290-330 nm. Saatujen PCR-amplikonien koosta riippuen käytetään geeliä, joka sisältää 1,5-2,5 % agaroosia. Agaroosigeelin valmistamiseksi agaroosin, puskurin ja veden seos sulatetaan mikroaaltouunissa tai vesihauteessa ja lisätään etidiumbromidiliuos. 50-60°C:een jäähdytetty seos kaadetaan muottiin 4-6 mm paksuisella kerroksella ja erityisillä kammoilla tehdään geeliin taskuja näytteen levittämistä varten. Kammat asetetaan siten, että kuoppien pohjan ja geelin pohjan väliin jää 0,5-1 mm agaroosikerros. Kun geeli on jähmettynyt, taskuihin laitetaan amplifikaattia 5-15 µl. On suositeltavaa suorittaa elektroforeesi DNA-fragmentin pituusmarkkerien seoksesta rinnakkain kontrolli- ja koenäytteiden kanssa. Tyypillisesti tällainen seos sisältää kymmenen DNA-fragmenttia, jotka ovat 100, 200, 300 jne. pitkiä emäsparia.

Asettamalla tällaisen näytteen voit tarkistaa amplikonien pituuden kontrolli- ja koenäytteissä. Geeli levitetyllä näytteellä siirretään puskurilla täytettyyn elektroforeesikammioon, kammio liitetään virtalähteeseen ja vahvistustuotteiden elektroforeettinen erotus suoritetaan 30-45 minuutin ajan sähkökentän voimakkuudella 10-15 V/cm. Tässä tapauksessa reaktioseokseen kuuluvan väriaineen etuosan on ylitettävä vähintään 3 cm.

Elektroforeesin päätyttyä geeli siirretään transilluminaattorin lasille ja sitä tarkastellaan ultraviolettivalossa. Dokumentaatiota varten geeli kuvataan Mikrat 300 -filmille tai tallennetaan tietokoneeseen liitetyn videojärjestelmän avulla.

Kontrollinäytteet arvioidaan ensin. Positiivista kontrollia vastaavassa elektroforeettisessa kaistassa tulee olla oranssi valonauha. Sen elektroforeettisen liikkuvuuden tulee vastata ohjeissa määritettyä amplikonin pituutta.

Negatiivista kontrollia vastaavassa elektroforeettisessa radassa tällaista vyöhykettä ei pitäisi olla. Tällaisen juovan läsnäolo negatiivisessa kontrollissa osoittaa kontaminaatiota - käytettyjen reagenssien kontaminaatiota tutkitun DNA:n tai amplikonin kanssa. Testinäytteet arvioidaan sen perusteella, onko vastaavalla kaistalla vyöhyke, joka sijaitsee samalla tasolla kuin positiivisen kontrollinäytteen vyöhyke. Vyöhykkeen hehkun intensiteetti vastaa tutkittavan DNA:n määrää näytteessä, mikä mahdollistaa PCR:n semikvantitatiivisen arvioinnin. Yleensä positiivisia tuloksia arvioidaan nelipisteasteikolla. Jos koenäytteen nauhan hehku on erittäin heikko, tällainen näyte tulee järjestää uudelleen (kuva 12).

Riisi. 12. Elektroforeesi agaroosigeelissä.

PCR-sovelluksetpistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnostiikka

Yksi PCR:n johtavista sovellusalueista käytännön terveydenhuollossa on pistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnosointi. . DNA-diagnostiikassa on suoria ja epäsuoria menetelmiä. Niissä tilanteissa, joissa tunnetaan geeni, jonka vaurioituminen johtaa perinnöllisen sairauden kehittymiseen, tämä vaurio voidaan havaita molekyyligeneettisillä menetelmillä. Tällaisia ​​menetelmiä kutsutaan suoriksi. Suorien menetelmien avulla havaitaan häiriöt DNA:n primaarisessa nukleotidisekvenssissä (mutaatiot ja niiden tyypit). Suorille menetelmille on ominaista lähes 100 %:n tarkkuus.

Käytännössä näitä menetelmiä voidaan kuitenkin soveltaa tietyissä olosuhteissa.:

joilla on perinnöllisen sairauden kehittymisestä vastuussa olevan geenin tunnettu sytogeneettinen sijainti;

Taudin geeni on kloonattava ja sen nukleotidisekvenssi tunnettava.

Suoran DNA-diagnostiikan tavoitteena on tunnistaa mutanttialleelit.

Siten niissä tilanteissa, joissa tiedetään, millainen DNA-vaurio johtaa perinnölliseen sairauteen, vaurion sisältävä DNA-fragmentti tutkitaan suoraan eli käytetään DNA-diagnostiikan suoraa menetelmää.

Tähän mennessä monien sairauksien geenejä ei kuitenkaan ole kartoitettu, niiden eksoni-introniorganisaatiota ei tunneta, ja monet perinnölliset sairaudet jolle on ominaista selvä geneettinen heterogeenisyys, mikä ei salli suorien DNA-diagnostiikan menetelmien täyttä käyttöä. Siksi tapauksissa, joissa vaurion lokalisointia ei tiedetä, käytetään erilaista lähestymistapaa, joka liittyy geenisairaudesta vastuussa olevan geenin läheisyyden tutkimukseen yhdistettynä perheanalyysiin, toisin sanoen epäsuoriin molekyyligeneettisen diagnoosin menetelmiin. perinnöllisiä sairauksia käytetään.

Voidaan käyttää pistemutaatioiden ja pienten deleetioiden havaitsemiseen eri tavoilla ne kuitenkin kaikki perustuvat PCR-menetelmän käyttöön. Tämän reaktion avulla voit toistuvasti kertoa DNA:n nukleotidisekvenssin ja etsiä sitten mutaatioita. Menetelmät mutaatioita sisältävien DNA-fragmenttien etsimiseksi perustuvat vertaileva analyysi mutantti- ja normaali DNA-nukleotidisekvenssit.

PCR-tuotteiden analyysi

suoran DNA-diagnostiikan prosessissa

Se sisältää geenin monistetun alueen erityispiirteiden tutkimuksen. Siten trinukleotiditoistojen laajenemisen aiheuttamissa sairauksissa amplifikaatiotuotteet eroavat pituudeltaan (heijastavat erilaista määrää triplettejä tutkittavalla geenialueella) ja sen seurauksena niiden liikkumisnopeudessa geelissä. Tästä johtuen saadaan aikaan selkeä normaalien ja mutanttialleelien elektroforeettinen erottelu ja patologisesti pidentyneen fragmentin tarkka määritys, eli taudin DNA-diagnoosi (kuvio 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riisi. 14. Poiston diagnoosi GAG geenissä DYT 1 potilailla, joilla on dopa-riippumaton dystonia (polyakryyliamidigeelielektroforeesi). Jäljet ​​2,3,6 - sairas; kaistat 1,4,5 - ohjaus. Ohut nuoli osoittaa normaalia alleelia, lihavoitu nuoli osoittaa mutantti lyhyemmän alleelin (kolmen nukleotidin deleetio).

Jos tutkittava DNA-alue sisältyy kokonaan laajennettuun deleetioon, ei tästä deletoidusta alleelista DNA:n PCR-amplifikaatiota tehdä, koska alukehybridisaatiolle ei ole paikkoja. Tässä tapauksessa homotsygoottinen deleetio diagnosoidaan reaktion PCR-tuotteen täydellisen puuttumisen perusteella (DNA-synteesi on mahdotonta molemmista geenikopioista). Heterotsygoottisella deleetiolla on mahdollista havaita normaalista (turvallisesta) alleelista syntetisoitu PCR-tuote, mutta tällaisen mutaation luotettavaa diagnoosia varten on tarpeen käyttää kehittyneempiä DNA-visualisointimenetelmiä, jotka mahdollistavat lopullisen annoksen arvioimisen. PCR-tuote.

Pistemutaatioiden (useimmiten nukleotidisubstituutioiden) havaitsemiseksi tietyissä kohdissa PCR-menetelmää käytetään yhdessä muiden molekyyligeneettisen analyysin menetelmien kanssa. Jos ehdotetun pistemutaation sijainti ja luonne tiedetään tarkasti, tällaisen mutaation tarkoituksenmukaista havaitsemista varten restriktioendonukleaasit (rajoittaa) ovat erityisiä soluentsyymejä, jotka on eristetty eri bakteerikannoista.

Nämä entsyymit tunnistavat spesifisiä nukleotidisekvenssejä, joiden pituus vaihtelee neljästä kymmeneen nukleotidiin. Sitten he suorittavat näiden sekvenssien restriktio (lat. (leikkaus)) osana kaksijuosteista DNA-molekyyliä. Jokainen restriktioentsyymi tunnistaa ja leikkaa kiinteässä paikassa tiukasti määritellyn, spesifisen nukleotidisekvenssin - rajoituspaikka (tunnistuspaikka).

Tapauksissa, joissa pistemutaatio muuttaa tietyn restriktioentsyymin luonnollista tunnistuskohtaa, kyseinen entsyymi ei pysty katkaisemaan mutantti-PCR-monistettua fragmenttia. Joissakin tapauksissa mutaatio johtaa uuden tunnistuskohdan ilmestymiseen tietylle restriktioentsyymille, joka puuttuu normista.

Molemmissa tilanteissa valitulla restriktioentsyymillä käsitellyt mutantti- ja normaalit PCR-tuotteet antavat eripituisia restriktiofragmentteja, jotka voidaan helposti havaita elektroforeesilla (kuvio 15).

Siten, jos on tarpeen havaita nopeasti jokin tietty pistemutaatio, tehtävä rajoittuu vastaavan restriktioentsyymin etsimiseen, jonka tunnistuskohta on paikantunut häiriintyneen nukleotidisekvenssin kohtaan. PCR-tuotteiden käsittely tällä restriktioentsyymillä mahdollistaa normaalien ja mutanttien alleelien helpon erottamisen. Restriktioanalyysi yksinkertaistaa suuresti tunnettujen pistemutaatioiden havaitsemista ja sitä käytetään tällä hetkellä laajalti perinnöllisten sairauksien suorassa DNA-diagnoosissa.

viimeinen taso mutaatioiden molekyyligeneettinen analyysi on tutkitun DNA-fragmentin nukleotidisekvenssin määrittäminen (sekvensointi), jota verrataan normiin ja muotoillaan lopullinen geneettinen diagnoosi. Molekyyligenetiikan kehityksen ansiosta DNA-diagnostiikkamenetelmiä on nyt kehitetty yli 400 perinnölliseen sairauteen.

Riisi. 15. Pistemutaation havaitseminen restriktioanalyysillä: A - geenin monistettava alue, joka sisältää restriktiokohdanAGCTrestriktioendonukleaasiinAlu minä. MutaatioG→ Amuuttaa tätä nukleotidisekvenssiä, mikä johtaa restriktioentsyymiinAluitukossa; B - restriktiotuotteiden elektroferogrammi: kaista 1 - homotsygoottisuus normaalille alleelille; kaista 2, homotsygoottisuus mutaatiolle; kaista 3 - heterotsygoottinen tila (normaali alleeli + mutaatio).

Mutanttialleelien suoraan tutkimukseen perustuva perinnöllisten sairauksien diagnosointi potilailla, heidän perheenjäsenillään tai patologisten mutaatioiden oletetuilla heterotsygoottisilla kantajilla soveltuu pre-oireiseen ja synnytystä edeltävään diagnoosiin, jota voidaan soveltaa sikiön varhaisimmissa kehitysvaiheissa, ennen sikiön ilmenemistä. kliiniset tai biokemialliset oireet sairaus.

Huolimatta mutaation havaitsemismenetelmästä kunkin mutaation tarkka molekyylikarakterisointi voidaan saada vain suoralla sekvensoinnilla. Tämän prosessin automatisoimiseksi viime vuosina on käytetty laajalti erityisiä laitteita - sekvenssereitä, jotka mahdollistavat DNA-tietojen lukemisen merkittävästi nopeuttamisen.

Tie molekyylibiologisen tutkimuksen laajemmalle soveltamiselle kliinisissä diagnostisissa laboratorioissa avataan nopeuttamalla analyyttistä prosessia suorittamalla kaikki toimenpiteet samassa jatkumossa ilman näytteen siirtoa, luomalla olosuhteet kontaminaation estämiselle useiden analyyttien rinnakkaistestauksen aikana ja objektiivisella rekisteröinnillä kunkin syklin tuloksista.

PCR-menetelmän tärkeimmät muutokset

Käytetään tunnettujen geenimutaatioiden nopeaan skannaukseen ja etsimiseen.

Multipleksinen (monialuke) PCR

Tämä menetelmä perustuu tutkitun geenin useiden eksonien samanaikaiseen monistamiseen yhdessä reaktiossa. Tämä mahdollistaa yleisimpien mutaatioiden taloudellisen nopean seulonnan. Esimerkiksi dystrofiinigeenin deleetioiden kuljettamisen nopeasti diagnosoimiseksi potilailla, joilla on etenevä Duchenne/Becker-lihasdystrofia, tämän geenin useimmin mutatoituvien eksonien sarjaa monistetaan samanaikaisesti. Koska nämä sairaudet periytyvät X-kytketyssä resessiivisessä tyypissä ja ne liittyvät poikien ainoan X-kromosomin vaurioitumiseen, laajennetun deleetion tapauksessa reaktiotuotteiden elektroforeesi paljastaa yhden tai useamman DNA-fragmentin (eksonien) puuttumisen. ), joka voi toimia diagnoosin molekyylivahvistuksena. Lisäksi valitsemalla spesifiset geenialueet PCR-monistusta varten on mahdollista saada melko tarkka arvio deleetion ja geenikatkopisteiden kokonaispituudesta (eksoniin asti).

Useiden multipleksireaktioiden yhdistetty käyttö mahdollistaa jopa 98 % kaikista deleetioista, joita esiintyy potilailla, joilla on etenevä Duchenne/Beckerin lihasdystrofia. Tämä on noin 60 % dystrofiinigeenin tunnettujen mutaatioiden kokonaismäärästä ja osoittaa tämän seulontamenetelmän erittäin korkeaa tehokkuutta dystrofinopatian DNA-diagnoosissa (kuvio 16).

Riisi. 16. Duchennen lihasdystrofian suora DNA-diagnoosi moninkertaisella PCR:llä (agaroosigeelielektroforeesi). Jokaisessa tutkitussa yksilössä dystrofiinigeenin neljä eksonia monistettiin samanaikaisesti (eksonit 17, 19, 44 ja 45; nuolet osoittavat vastaavat monistustuotteet). Kaista 1 - kontrolli, kaistat 2-5 - potilaat, joilla on Duchennen lihasdystrofia, joissa on erilaisia ​​dystrofiinigeenin deleetioita (kaistat 2 ja 5 - eksonin 45 deleetio, kaista 3 - eksonin 44 deleetio, kaista 4 - eksonien 17 ja 19 deleetio ).

Alleelispesifinen vahvistus

Menetelmä perustuu kahden itsenäisen alukeparin käyttöön geenin tietylle alueelle: yksi aluke molemmissa pareissa on yhteinen, ja toisella alukkeella kussakin parissa on erilainen rakenne ja se on komplementaarinen joko normaaleille tai mutanteille DNA-sekvensseille. . Tällaisen liuoksessa tapahtuvan reaktion seurauksena voidaan syntetisoida samanaikaisesti kahden tyyppisiä PCR-tuotteita - normaaleja ja mutantteja. Lisäksi käytettyjen alukkeiden suunnittelu mahdollistaa normaalien ja mutanttien monistustuotteiden selkeän erottamisen niiden molekyylikoon perusteella. Tämä menetelmä on erittäin selkeä ja mahdollistaa mutanttialleelin sekä homo- että heterotsygoottisen kantamisen varmistamisen.

Menetelmä monistetun DNA:n kohdistettuun modifiointiin

Menetelmä perustuu ns. mismatch-alukkeen (ei täysin komplementaarisen templaatin kanssa) käyttöön PCR:ssä, joka eroaa templaatti-DNA-sekvenssistä yhdellä nukleotidilla. Määritellyn alukkeen sisällyttämisen mutantti-PCR-tuotteen koostumukseen seurauksena siihen muodostuu keinotekoisesti luotu restriktiokohta yhdelle restriktioendonukleaasille, mikä mahdollistaa tietyn tunnetun mutaation suoran DNA-diagnoosin restriktioanalyysin avulla. Tällaisen keinotekoisen restriktiokohdan luominen voi olla tarpeen, jos haku ei paljasta tunnetun ja saatavilla olevan entsyymin olemassaoloa, jonka "luonnolliseen" restriktiokohtaan vaikuttaa tutkitun mutaation ilmaantuminen DNA-molekyyliin. .

Käänteistranskriptaasi PCR -menetelmä (RT- PCR)

Tätä menetelmää käytetään tapauksissa, joissa on kätevämpää käyttää tutkimuksen kohteena ei genomista DNA:ta, vaan kompaktimpaa ja informaatiorikkaampaa cDNA:ta, joka saadaan kudosnäytteiden, kuten biopsiamateriaalin tai lymfosyyttien, fibroblastien solulinjojen, asianmukaisen käsittelyn jälkeen. jne. Tärkeä ehto tässä on halutun geenin ilmentyminen (ainakin minimaalinen) tutkittavassa kudoksessa.

Ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan mRNA:n käänteistranskriptio, ja tuloksena olevat cDNA-molekyylit toimivat templaattina PCR:lle. Tämän jälkeen riittävässä määrin amplifioitu kriittinen cDNA-alue altistetaan sekvensointi- ja muille mutaatioseulontamenetelmille, suoralle elektroforeettiselle tutkimukselle (deleetioiden, insertioiden jne. havaitseminen) tai integroiminen ekspressiojärjestelmään proteiinituotteen ja sen suoran analyysin saamiseksi. .

Tämä menetelmä on erityisen tehokas "typistetyn" proteiinin synteesiin johtavien mutaatioiden havaitsemiseen (nonsense-mutaatiot, silmukointimutaatiot, suuret deleetiot) - ns. PTT-analyysi (Protein Truncation Test). PTT-analyysiä käytetään yleisesti tutkittaessa laajennettuja monieksonigeenejä, kuten Duchenne/Beckerin lihasdystrofian, ataksia-telangiektasian tai tyypin 1 neurofibromatoosin geeniä.

reaaliaikainen PCR(Reaaliaikainen PCR)

Joka vuosi käytännön terveydenhuollossa reaaliaikaisesta PCR:stä on tulossa yhä suositumpi diagnostinen menetelmä. Sen perusominaisuus on pkertymisen seuranta ja kvantitatiivinen analyysi sekä tulosten automaattinen rekisteröinti ja tulkinta. Tämä menetelmä ei vaadi elektroforeesivaihetta, mikä vähentää PCR-laboratorion vaatimuksia. Tuotantotilan säästöjen, henkilöstömäärän vähenemisen ja DNA/RNA-määrityksen kysynnän ansiosta tätä menetelmää on viime vuosina käytetty menestyksekkäästi maailman kehittyneiden maiden suurimmissa saniteettiepidemia-, diagnostiikka- ja tutkimuskeskuksissa. korvaamalla PCR:n nykyisessä ("klassisessa") muodossaan.

Reaaliaikainen PCR käyttää fluoresoivasti leimattuja oligonukleotidikoettimia DNA:n havaitsemiseen monistuksen aikana. Reaaliaikainen PCR mahdollistaa näytteen täydellisen analyysin 20-60 minuutissa ja pystyy teoriassa havaitsemaan jopa yhden DNA- tai RNA-molekyylin näytteestä.

Riisi. 17. PCR reaaliajassa.

Reaaliaikainen PCR käyttää TaqMan-järjestelmää ohjaamaan PCR-kinetiikkaa suoraan monistuksen aikana käyttämälläa. Detektioon käytetään koetinta, jossa on fluorofori ja sammuttaja, jotka ovat komplementaarisia monistetun fragmentin keskiosalle. Kun fluorofori ja sammuttaja on sidottu oligonukleotidikoettimeen, havaitaan vain pieni määrä fluoresoivaa emissiota. Monistusprosessin aikana Taq-polymeraasin 5'-eksonukleaasiaktiivisuuden vuoksi fluoresoiva leima siirtyy liuokseen, vapautuen sammuttimen läheisyydestä ja tuottaa fluoresoivan signaalin, joka kasvaa reaaliajassa suhteessa aineen kertymiseen. amplifioi (kuva 17).

PCR-Real-Time tärkeimmät edut verrattuna PCR:ään geelielektroforeesilla:

Koko menetelmä suoritetaan yhdessä koeputkessa;

· Menetelmä kestää 1 tunnin;

Tarpeeksi 1-2 työhuonetta;

Tuloksen kvalitatiivisen arvioinnin ohella se on mahdollista kvantifioida (esimerkiksi määrättäessä antiviraalista hoitoa AIDSiin tai virushepatiittiin on tiedettävä viruskuorma eli viruksen määrä 1 yksikköä kohti, mikä tarjoaa todellisen -aika-PCR);

· Vähentää dramaattisesti kontaminaatioriskiä.

Johtopäätös

PCR-menetelmä on yksi yleisimmistä molekyylibiologisen tutkimuksen menetelmistä. Kliinikoiden tulee käyttää tätä menetelmää mielekkäästi, ja lääkärillä, joka päättää käyttää PCR:ää työssään, on oltava tiettyjä tietoja tämän menetelmän ominaisuuksista ja ominaisuuksista. Toiseksi kliinikon ja PCR-laboratorion välillä tulee olla tiivistä palautetta, joka on tarpeen monimutkaisten tapausten analysoimiseksi ja oikean diagnostisen strategian kehittämiseksi. Kolmanneksi PCR-analyysi ei ole ihmelääke diagnoosissa (ensisijaisesti tartuntatautien) eikä korvaa olemassa olevia tutkimusmenetelmiä, vaan ainoastaan ​​täydentää niitä. Ja mikä tärkeintä, PCR ei voi korvata intuitiota ja analyyttistä ajattelua, jota menestystä odottavalla lääkärillä pitäisi olla.

P . S . Molekyylibiologiset tutkimukset - diagnostiikan ja hoidon vertailupisteiden muutos. Molekyylibiologisten menetelmien käyttöön liittyy potentiaalinen radikaali muutos laboratoriodiagnostiikassa. Emme voi puhua vain oikea-aikaisesta tiedosta, vaan sen ennakkovastaanotosta. Jos nyt laboratoriotutkimukset tehdään useimmiten jo edenneen taudin kanssa ja hoito aloitetaan, niin molekyylibiologisen laboratoriotiedon odotetaan mahdollistavan henkilön taipumuksen tietyntyyppisiin patologioihin ja herkkyysasteen tunnistamisen tietyille lääkkeille. mahdollistaa tulevaisuuden lääketieteen ennakoivan, ennaltaehkäisevän ja yksilöllisen luonteen perustelemisen.

DIAGNOOSIN JA HOIDON POIKKEUSTEN MUUTTAMINEN

PERINNÄLLISET SAIraudet

Tänään Tulevaisuudessa

Diagnoosi Geneettinen passi

8. Kuinka monta työhuonetta tarvitaan PCR-laboratorioon, jossa on fluoresenssin havaitseminen (kvantitatiivinen analyysi, Real-Time PCR)?

9. Mitä on havaitseminen?

10. Mitä DNA-diagnostiikan menetelmiä erotetaan?

11. Mikä entsyymi toimii PCR:n perusteella?

12. Miksi tunnistusalue on erotettava muista työalueista?

13. Mikä on rajoitussivusto?

14. Mitä eroa on suoralla DNA-diagnostiikan menetelmällä ja epäsuoralla?

15. Mitä on sekvensointi?

16. Mikä on multipleksinen PCR?

17. Minkä tyyppiset mutaatiot määritetään PCR:llä?

18. Mitä on kontaminaatio?

19. Mikä on alleelispesifisen amplifikaatiomenetelmän ydin?

20. PCR-materiaalin säilytysolosuhteet?

21. Mitä laitetta käytetään vahvistukseen?

22. Mikä on käänteistranskriptaasi-PCR:n (RT-PCR) menetelmä?

23. Mikä on PCR-diagnostiikan materiaali?

24. Luettelo kontaminaatiotyypit?

Testit itseopiskeluun

1. Restriktioendonukleaasit:

a) entsyymit, jotka "murtavat" DNA:ta tiukasti määrätyissä paikoissa;

b) entsyymit, jotka ompelevat taukoja DNA-molekyyliin;

c) entsyymit, jotka tuottavat yhdisteitä, jotka suorittavat DNA:n korjauksen.

2. Geenien monistus:

3. Mitä molekyyligenetiikan menetelmistä käytetään tunnetun sekvenssin mukaisen mutanttigeenin aiheuttamien sairauksien diagnosointiin?

a) tietyn rajoittamisen käyttö;

b) suora havaitseminen käyttämällä spesifisiä molekyylikoettimia;

V) perheanalyysi normaalin restriktiofragmentin pituuden polymorfismin jakautuminen.

4. DNA-sekvensointi:

a) DNA-emässekvenssin tunnistaminen;

b) minkä tahansa DNA-segmentin toistuva toisto;

c) tutkitun geenin sisältävän DNA-fragmentin eristäminen.

5. DNA-näytteitä voidaan saada käyttämällä :

b) korionivilli;

c) lapsivesi;

d) lapsivesisolut;

e) biopsiat ihosta, lihaksista, maksasta,

e) kaikki on oikein, paitsi kohta "c",

g) kaikki on oikein paitsi kohta "d",

h) Kaikki yllä olevat pitävät paikkansa.

6. Mitkä mutaatiot diagnosoidaan PCR:llä?

a) genominen;

b) kromosomaalinen;

c) geeni (piste).

7. Pohja on:

a) komplementaarinen osa DNA:ta;

b) synteettinen oligonukleotidileimattu (radioaktiivisesti tai fluoresoivasti) sekvenssi, joka on komplementaarinen mutantille tai normaalille geenille;

c) oligonukleotidi, joka toimii "siemenenä" ja aloittaa polynukleotidiketjun synteesin DNA- tai RNA-templaatissa.

8. Kuka kehitti PCR-menetelmän periaatteen?

b) K. Mullis

9. Käytetäänkö PCR-menetelmää trinukleotiditoistojen (dynaamisten mutaatioiden) laajenemisen diagnosoimiseen?

10. Millä aloilla PCR:ää käytetään?

a) kliininen lääketiede;

b) siirtogeenisten organismien (GMO) määritelmä

c) henkilön tunnistaminen, isyyden vahvistaminen, kriminalistiikka

d) kaikki edellä mainitut

d) ei mikään yllä olevista.

Esimerkkivastaukset: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - sisään; 7 - sisään; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Main

1. Bochkovin genetiikka. Moskova. GEOTAR, 2002.

Lisätiedot

1., Bakharev ja lasten synnynnäisten ja perinnöllisten sairauksien hoito. - Moskova, 2004.

2. DNA-diagnostiikka ja lääketieteellinen geneettinen neuvonta. - Moskova, 2004.

3. Gintergenetiikka. - Moskova, 2003.

4. Gorbunov lääketieteellisen genetiikan perusteet. - Pietari: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekyyli kliininen diagnostiikka. – Maailma, 1999.

6. Menshikov - kliinisen laboratoriodiagnostiikan biologinen tutkimus: ongelman mahdollisuudet (luennot). Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 3, 2006.

7. Kornienko PCR-laboratorion työstä biologisen materiaalin in-line-analyysin aikana. Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 10, 2006.

8. PCR-laboratorion työn organisointi. Menetelmäohjeet. MU 1.3.1794-03. Venäjän federaation johtava terveyslääkäri, 2003.

9. Erlich H. A. PCR-tekniikka. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR. Genome Res. - nro 6, 1996.

MENETELMÄN PÄÄPERIAATTEET

POLYMERAASI KETJUREAKTIO

Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja lastenlääketieteen (060103) erikoisalojen 3-4 kurssin opiskelijoille.

SEI HPE "liittovaltion terveys- ja sosiaalisen kehityksen viraston Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia"

Venäjä, Krasnojarsk,

Liittovaltion koulutusvirasto

Osavaltio oppilaitos

Ylin ammatillinen koulutus

"Karjalan valtion pedagoginen akatemia"

Kurssityö aiheesta:

Polymeraasiketjureaktio (PCR) ja sen käyttö

Suorittanut: opiskelija Koryagina Valeria Alexandrovna

Tarkastaja: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petroskoi 2013

Johdanto

Luku 1 Kirjallisuuskatsaus

1.5.4 Tasannevaikutus

1.5.6 Vahvistus

Johtopäätös

Johdanto

Viimeiset kaksikymmentä vuotta ovat olleet molekyyligeneettisten menetelmien laajalle levinneelle käyttöönotolle biologian, lääketieteen ja maatalouden tieteissä.

1970-luvun alussa näytti siltä, ​​että molekyylibiologia oli saavuttanut tietyn täydellisyyden. Tänä aikana mikro-organismit olivat molekyyligeneettisen tutkimuksen pääkohde. Siirtyminen eukaryooteihin toi tutkijoille täysin uusia ongelmia, joita ei voitu ratkaista tuolloin olemassa olevilla geneettisen analyysin menetelmillä. Läpimurto molekyyligenetiikan kehityksessä tuli mahdolliseksi uuden kokeellisen työkalun - restriktioendonukleaasien - syntymisen ansiosta. Seuraavina vuosina laadullisesti erilaisiin lähestymistapoihin perustuvien suorien DNA-analyysimenetelmien määrä alkoi kasvaa nopeasti.

Monissa tapauksissa modernit teknologiat ovat mahdollistaneet eri organismien ydin- ja ekstranukleaaristen genomien hienon rakenteellisen ja toiminnallisen järjestyksen tutkimisen syvemmällä tasolla. Tämä oli erityisen tärkeää uusien diagnoosi- ja hoitomenetelmien kehittämisen kannalta. erilaisia ​​sairauksia. Vähemmän tärkeä oli mahdollisuus käyttää molekyyligenetiikan saavutuksia populaatiobiologiassa ja jalostuksessa populaatioiden, lajikkeiden ja kantojen geneettisen vaihtelevuuden tunnistamiseen ja analysointiin, taloudellisesti arvokkaiden yksilöiden tunnistamiseen ja sertifiointiin, muuntogeenisten organismien luomiseen ja muiden ongelmien ratkaisemiseen.

Jokaisella menetelmällä on omat etunsa ja haittansa. Ei ole olemassa universaalia menetelmää, joka voisi ratkaista kaikki esiin tulevat ongelmat. Siksi tietyn menetelmän valinta meneillään olevaan tutkimukseen on yksi tieteellisen työn tärkeimmistä vaiheista.

Luku 1 Kirjallisuuskatsaus

1.1 Polymeraasiketjureaktion (PCR) löydön historia

Vuonna 1983 K.B. Mullis ym. julkaisivat ja patentoivat polymeraasiketjureaktiomenetelmän (PCR), jolla oli tarkoitus olla syvällinen vaikutus kaikilla nukleiinihappojen tutkimuksen ja soveltamisen aloilla. Tämän menetelmän arvo molekyylibiologia ja genetiikka osoittautui niin hienoksi ja ilmeiseksi, että seitsemän vuoden kuluttua kirjailija palkittiin Nobel palkinto kemiassa.

Menetelmän käytön alussa jokaisen kuumennus-jäähdytyssyklin jälkeen reaktioseokseen oli lisättävä DNA-polymeraasia, koska se inaktivoitui DNA-heliksiketjujen erottamiseen tarvittavassa korkeassa lämpötilassa. Reaktiomenetelmä oli suhteellisen tehoton ja vaati paljon aikaa ja entsyymiä. Vuonna 1986 polymeraasiketjureaktiomenetelmää parannettiin merkittävästi. Termofiilisten bakteerien DNA-polymeraasien käyttöä on ehdotettu. Nämä entsyymit osoittautuivat lämpöstabiileiksi ja kestivät monia reaktiojaksoja. Niiden käyttö mahdollisti PCR:n yksinkertaistamisen ja automatisoinnin. Yksi ensimmäisistä lämpöstabiileista DNA-polymeraaseista eristettiin bakteereista Thermus aquaticusja nimetty Taq-polymeraasi.

Mahdollisuus monistaa mitä tahansa DNA-segmenttiä, jonka nukleotidisekvenssi tunnetaan, ja saada se PCR:n jälkeen homogeenisessa muodossa ja preparatiivisena määränä, tekee PCR:stä vaihtoehtoisen menetelmän lyhyiden DNA-fragmenttien molekyylikloonaukseen. Ei ole tarvetta soveltaa monimutkaisia ​​metodologisia tekniikoita, joita käytetään geenitekniikka tavanomaisella kloonauksella. PCR-menetelmän kehitys on laajentanut merkittävästi molekyyligenetiikan ja erityisesti geenitekniikan metodologisia mahdollisuuksia niin paljon, että se on radikaalisti muuttanut ja vahvistanut monien alueidensa tieteellistä potentiaalia.

1.2 Polymeraasiketjureaktion (PCR) lajikkeet

· Sisäkkäinen PCR- käytetään vähentämään reaktion sivutuotteiden määrää. Käytä kahta paria alukkeita ja suorita kaksi peräkkäistä reaktiota. Toinen alukepari monistaa DNA-alueen ensimmäisen reaktion tuotteessa.

· Käänteinen PCR- käytetään, kun tunnetaan vain pieni alue halutusta sekvenssistä. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen, kun on tarpeen määrittää vierekkäiset sekvenssit sen jälkeen, kun DNA on insertoitu genomiin. Käänteisen PCR:n toteuttamiseksi suoritetaan sarja DNA-leikkauksia restriktioentsyymeillä<#"justify">polymeraasiketjureaktioaluke

· Ryhmäspesifinen PCR- PCR sukulaisille<#"center">1.3 Polymeraasiketjureaktio

1980-luvun puolivälissä löydetty polymeraasiketjureaktio (PCR) voi lisätä alkuperäisen näytteen kopioiden määrää miljoonia kertoja muutamassa tunnissa. Jokaisen reaktiosyklin aikana alkuperäisestä molekyylistä muodostuu kaksi kopiota. Jokainen syntetisoiduista DNA-kopioista voi toimia templaattina uusien DNA-kopioiden synteesille seuraavassa syklissä. Siten jaksojen toistuva toistaminen johtaa kopioiden määrän kasvuun geometrinen eteneminen. Laskelmista seuraa, että vaikka jaksoja olisi 30, alkuperäisen molekyylin kopioiden määrä on yli 1 miljardi. Vaikka otamme huomioon, että kaikki amplikonit eivät monistu jokaisen jakson aikana, kopioiden kokonaismäärä on tästä huolimatta melko suuri luku.

Jokainen polymeraasiketjureaktion (PCR) sykli koostuu seuraavista vaiheista:

· Denaturaatio - Lämpötilan nousu saa kaksijuosteisen DNA-molekyylin purkamaan ja jakautumaan kahdeksi yksijuosteiseksi;

· Hehkutus - Lämpötilan alentaminen mahdollistaa alukkeiden kiinnittymisen DNA-molekyylin komplementaarisille alueille;

· Pidentyminen – DNA-polymeraasientsyymi täydentää komplementaarisen juosteen.

Valitun fragmentin monistamiseen käytetään kahta oligonukleotidialuketta (siementä), jotka reunustavat tiettyä DNA-aluetta. Pohjustussuuntaiset 3 - päättyy toisiaan kohti ja vahvistettavan sekvenssin suuntaan. DNA-polymeraasi suorittaa toisiaan täydentävien DNA-ketjujen synteesin (täydennyksen) alkaen alukkeista. DNA-synteesin aikana alukkeet liitetään fyysisesti vastasyntetisoitujen DNA-molekyylien ketjuun. Jokainen DNA-molekyylin juoste, joka on muodostettu käyttämällä yhtä alukkeista, voi toimia templaattina komplementaarisen DNA-juosteen synteesille toista aluketta käyttämällä.

1.4 Polymeraasiketjureaktion (PCR) suorittaminen

Polymeraasiketjureaktio suoritetaan erityisissä ohutseinäisissä polypropeenikoeputkissa, jotka ovat kooltaan yhteensopivat käytetyn lämpösyklilaitteen (vahvistimen) kanssa - laite, joka ohjaa polymeraasiketjureaktion (PCR) vaiheiden lämpötilaa ja aikaominaisuuksia. .

1.5 Polymeraasiketjureaktiomenetelmän periaate

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on in vitro DNA:n monistusmenetelmä, jolla voidaan eristää ja monistaa tietty DNA-sekvenssi miljardeja kertoja muutamassa tunnissa. Mahdollisuus saada valtava määrä kopioita tiukasti tiettyä aluetta genomi yksinkertaistaa huomattavasti olemassa olevan DNA-näytteen tutkimista.

Polymeraasiketjureaktion suorittamiseksi on täytyttävä useita ehtoja:

1.5.1 Useiden komponenttien läsnäolo reaktioseoksessa

Reaktioseoksen (PCR) pääkomponentit ovat: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotiditrifosfaattien seos (ATP, GTP, CTP, TTP), alukkeet (oligonukleotidit), analysoitu DNA-valmiste, lämpöstabiili DNA-polymeraasi. Jokainen reaktioseoksen komponenteista on suoraan osallisena polymeraasiketjureaktiossa (PCR), ja reagenssien pitoisuus vaikuttaa suoraan monistumisen kulkuun.

· Tris-HCl - määrittää reaktioseoksen pH:n, luo puskurikapasiteetin. DNA-polymeraasin aktiivisuus riippuu väliaineen pH:sta, joten pH:n arvo vaikuttaa suoraan polymeraasiketjureaktion etenemiseen. Yleensä pH-arvo on välillä 8 - 9,5. Korkea pH johtuu siitä, että lämpötilan noustessa Tril-HCl-puskurin pH laskee.

· KCl - kaliumkloridin pitoisuus jopa 50 mm:iin vaikuttaa denaturaatio- ja pariutumisprosessien kulkuun, yli 50 mm:n pitoisuus estää DNA-polymeraasia.

· MgCl 2- koska DNA-polymeraasi on Mg 2+- riippuvainen entsyymi, niin magnesium-ionien pitoisuus vaikuttaa entsyymin aktiivisuuteen (Mg 2+muodostaa komplekseja NTP:n kanssa - juuri nämä kompleksit ovat polymeraasin substraatti). Suuri pitoisuus johtaa epäspesifisen monistumisen lisääntymiseen ja pieni johtaa reaktion estoon, optimi (eri polymeraaseille) on alueella 0,5 - 5 mM. Lisäksi magnesiumsuolojen pitoisuus vaikuttaa denaturaatio- ja hehkutusprosessien kulumiseen - Mg-pitoisuuden nousu 2+aiheuttaa nousun DNA:n sulamislämpötilassa (eli lämpötilassa, jossa 50 % kaksijuosteisista DNA-säikeistä hajoaa yksijuosteisiksi juosteiksi).

· NTP - nukleotiditrifosfaatit ovat nukleiinihappojen suoria monomeerejä. Ketjun päättymisen estämiseksi suositellaan kaikkien neljän nukleotiditrifosfaatin yhtäläistä suhdetta. Näiden komponenttien alhainen pitoisuus reaktioseoksessa lisää virheiden todennäköisyyttä komplementaarisen DNA-juosteen rakentamisessa.

· Pohjusteet - Optimaalisin on käyttää alukkeita, joiden sulamispisteero on enintään 2 - 4 o C. Joskus pitkäaikaisen varastoinnin aikana 4 °C:n lämpötilassa o Useiden jäädytysten - sulatusten yhteydessä tai sen jälkeen alukkeet muodostavat sekundaarisia rakenteita - dimeerejä, mikä vähentää PCR:n tehokkuutta. Tämän ongelman poistaminen pelkistyy inkubaatioon vesihauteessa (T = 95 o C) 3 minuuttia ja sen jälkeen nopea jäähdytys 0 °C:seen KANSSA.

· DNA-valmisteet - DNA-valmisteen (matriisin) määrä ja laatu vaikuttavat suoraan polymeraasiketjureaktion kulkuun ja parametreihin. Ylimääräinen DNA-näyte estää polymeraasiketjureaktion (PCR). epäpuhtaudet erilaisia ​​aineita, jotka ovat DNA-valmisteessa, voivat myös vähentää polymeraasiketjureaktion (PCR) tehokkuutta: natriumasetaatti, natriumkloridi, isopropanoli, etanoli, hepariini, fenoli, urea, hemoglobiini jne.

· DNA-polymeraasi - käytettäessä pientä määrää DNA-polymeraasia, lopputuotteen synteesin väheneminen havaitaan suoraan suhteessa fragmenttien kokoon. Polymeraasin 2-4-kertainen ylimäärä johtaa diffuusien spektrien ilmaantumiseen ja 4-16-kertaiseen - matalan molekyylipainon epäspesifisten spektrien ilmestymiseen. Käytetty konsentraatioalue on 0,5 - 1,5 aktiivisuusyksikköä 25 ul:ssa PCR-seosta.

PCR-seoksen pääkomponenttien lisäksi käytetään useita muita aineita, jotka parantavat PCR:n laadullisia ja kvantitatiivisia indikaattoreita: asetamidi (5%) - pääkomponenttien liukoisuuden lisääntyminen; betaiini ( natriumsuolaa) - DNA-polymeraasin stabilointi, DNA:n sulamispisteen alentaminen, sulamispisteen tasaaminen; naudan albumiini (10-100 μg / ml) - DNA-polymeraasin stabilointi; dimetyylisulfoksidi (1-10 %) - lisää pääkomponenttien liukoisuutta; formamidi (2-10 %) - hehkutuksen spesifisyyden kasvu; glyseroli (15-20%) - entsyymin lämpöstabiilisuuden kasvu, DNA-näytteen denaturaatiolämpötilan lasku; ammoniumsulfaatti - denaturoinnin ja hehkutuksen lämpötilan alentaminen.

1.5.2 Jakso ja lämpötila

Yleinen näkemys polymeraasiketjureaktio (PCR) -ohjelmasta on seuraava:

vaiheessa. DNA-valmisteen pitkittynyt primaarinen denaturaatio.1 sykli

vaiheessa. DNA-valmisteen nopea denaturaatio. Pohjustushehkutus. Pidentymä.30 - 45 sykliä.

vaiheessa. Pitkittynyt venyminen. Reaktioseoksen jäähdytys 1 sykli.

Jokaisella vaiheen elementillä - denaturaatiolla, hehkutuksella, venymällä - on yksilölliset lämpötila- ja aikaominaisuudet. Jokaisen elementin lämpötilan ja virtausajan parametrit valitaan empiirisesti vahvistustuotteiden kvalitatiivisten ja kvantitatiivisten indikaattoreiden mukaisesti.

Denaturaatio. Tämän polymeraasiketjureaktion elementin aikana kaksijuosteinen DNA-molekyyli jaetaan kahdeksi yksijuosteiseksi. Denaturoinnin lämpötilaparametrit ovat välillä 90 - 95 o C, mutta jos DNA-näyte sisältää runsaasti guaniinia ja sytosiinia, lämpötila tulisi nostaa 98 asteeseen. o C. Denaturointilämpötilan tulisi olla riittävä denaturoimaan täydellisesti - katkaisemaan DNA-säikeet ja välttämään "äkillistä jäähtymistä" tai nopeaa pariutumista, mutta lämpöstabiili DNA-polymeraasi on vähemmän stabiili korkeissa lämpötiloissa. Siten optimaalisten denaturaatiolämpötilaparametrien valinta aluke/näyte-suhteelle (DNA-valmistelu) on tärkeä ehto monistumiselle. Jos denaturointilämpötila ensimmäisessä vaiheessa on yli 95 o C, suositellaan DNA-polymeraasin lisäämistä reaktioseokseen primaarisen denaturoinnin jälkeen. Tämän vaiheen elementin keston polymeraasiketjureaktion (PCR) aikana tulisi olla riittävä DNA:n täydelliseen denaturoitumiseen, mutta se ei kuitenkaan vaikuta merkittävästi DNA-polymeraasin aktiivisuuteen tietyssä lämpötilassa.

Hehkutus. Hehkutuslämpötila (T A ) on yksi polymeraasiketjureaktion tärkeimmistä parametreista. Hehkutuslämpötila kullekin tietylle pohjamaalille valitaan erikseen. Se riippuu alukkeen pituudesta ja nukleotidikoostumuksesta. Yleensä se on pienempi 2-4 o Sulamispistearvosta (T m ) pohjamaali. Jos järjestelmän pariutumislämpötila on alle optimaalisen, epäspesifisten monistuneiden fragmenttien määrä kasvaa ja päinvastoin enemmän lämpöä vähentää vahvistettujen tuotteiden määrää. Tässä tapauksessa spesifisten amplikonien pitoisuus voi laskea jyrkästi polymeraasiketjureaktion (PCR) estämiseen asti. Pariutumisajan pidentäminen johtaa myös epäspesifisten amplikonien määrän kasvuun.

Pidentymä. Tyypillisesti kullakin lämpöstabiililla DNA-polymeraasityypillä on yksilöllinen aktiivisuuden lämpötilaoptimi. Komplementaarisen DNA-juosteen synteesinopeus entsyymin toimesta on myös kullekin polymeraasille spesifinen arvo (keskimäärin 30–60 nukleotidia sekunnissa eli 1–2 tuhatta emästä minuutissa), joten venymisaika valitaan riippuen. DNA-polymeraasin tyypistä ja monistetun alueen pituudesta.

1.5.3 Pohjusteen valinnan perusperiaatteet

PCR-testijärjestelmää luotaessa yksi tärkeimmistä tehtävistä on oikea alukkeiden valinta, joiden on täytettävä useita kriteerejä:

Pohjusteiden on oltava erityisiä. Erityistä huomiota maksaa 3 - alukkeiden päät, koska juuri niistä Taq-polymeraasi alkaa täydentää komplementaarista DNA-ketjua. Jos niiden spesifisyys on riittämätön, on todennäköistä, että koeputkessa tapahtuu ei-toivottuja prosesseja reaktioseoksen kanssa, nimittäin epäspesifisen DNA:n (lyhyiden tai pitkien fragmenttien) synteesi. Se näkyy elektroforeesissa raskaiden tai kevyiden lisänauhojen muodossa. Tämä tekee reaktion tulosten arvioinnin vaikeaksi, koska on helppo sekoittaa tietty monistustuote syntetisoituun vieraaseen DNA:han. Osa alukkeista ja dNTP:istä kuluu epäspesifisen DNA:n synteesiin, mikä johtaa merkittävään herkkyyden menettämiseen.

Pohjusteet eivät saa muodostaa dimeerejä ja silmukoita, ts. stabiileja kaksoissäikeitä ei saa muodostaa hehkuttamalla alukkeet toisiinsa tai toisiinsa.

1.5.4 Tasannevaikutus

On huomattava, että spesifisten vahvistustuotteiden kertymisprosessi kestää eksponentiaalisesti vain rajoitetun ajan, ja sitten sen tehokkuus laskee kriittisesti. Tämä johtuu niin kutsutusta "tasangon" vaikutuksesta.

termin vaikutus tasangolla käytetään kuvaamaan PCR-tuotteiden kertymisprosessia viimeisissä monistussykleissä.

Riippuen monistusreaktion olosuhteista ja syklien lukumäärästä sillä hetkellä, kun vaikutus saavutetaan tasangolla substraattien (dNTP:t ja alukkeet) käyttö, reaktanttien (dNTP ja entsyymi) stabiilisuus, inhibiittoreiden määrä, mukaan lukien pyrofosfaatit ja DNA-dupleksit, kilpailu reaktanteista epäspesifisten tuotteiden tai aluke-dimeerien kanssa, tietyn tuotteen pitoisuus , ja epätäydellinen denaturaatio suurilla amplifikaatiotuotteiden pitoisuuksilla.

Mitä pienempi kohde-DNA:n alkupitoisuus, sitä suurempi on reaktion riski tasanne". Tämä kohta voi tapahtua ennen kuin tiettyjen vahvistustuotteiden määrä on riittävä analysoitavaksi. Vain hyvin optimoidut testijärjestelmät voivat välttää tämän.

1.5.5 Näytteenkäsittely biologisesta materiaalista

DNA:n erottamiseen käytetään erilaisia ​​tekniikoita tehtävistä riippuen. Niiden ydin on DNA:n uuttaminen (uutto) biologisesta tuotteesta ja vieraiden epäpuhtauksien poistaminen tai neutralointi, jotta saadaan DNA-valmiste, jonka puhtaus on sopiva PCR:lle.

Marmurin kuvaamaa menetelmää puhtaan DNA-valmisteen saamiseksi pidetään standardina ja siitä on jo tullut klassinen. Se sisältää entsymaattisen proteolyysin, jota seuraa proteiininpoisto ja DNA:n uudelleensaostus alkoholilla. Tämä menetelmä mahdollistaa puhtaan DNA-valmisteen saamisen. Se on kuitenkin melko työlästä ja vaatii työskentelyä sellaisten aggressiivisten ja pistäviä aineita kuin fenoli ja kloroformi.

Yksi tällä hetkellä suosituista menetelmistä on DNA:n erotusmenetelmä, jonka ovat ehdottaneet Boom et ai. Tämä menetelmä perustuu vahvan kaotrooppisen aineen, guanidiinitiosyanaatin (GuSCN) käyttöön solujen hajoamiseen ja sitä seuraavaan DNA:n sorptioon kantajalle (lasihelmet, piimaa, lasimaito jne.). Pesujen jälkeen DNA jää kantajalle adsorboituneeseen näytteeseen, josta se voidaan helposti poistaa eluointipuskurilla. Menetelmä on kätevä, teknisesti edistyksellinen ja soveltuu näytteiden valmisteluun monistusta varten. DNA-häviöt ovat kuitenkin mahdollisia johtuen peruuttamattomasta sorptiosta kantajalle sekä lukuisten pesujen aikana. Tämä on erityisen tärkeää, kun näytteessä on pieniä määriä DNA:ta. Lisäksi jopa vähäiset määrät GuSCN:ää voivat estää PCR:n. Siksi tätä menetelmää käytettäessä se on erittäin tärkeää oikea valinta sorbentti ja teknisten vivahteiden huolellinen noudattaminen.

Toinen ryhmä näytteenvalmistusmenetelmiä perustuu Chilex-tyyppisten ioninvaihtimien käyttöön, jotka toisin kuin lasi eivät adsorboi DNA:ta, vaan päinvastoin reaktiota häiritseviä epäpuhtauksia. Tämä tekniikka sisältää yleensä kaksi vaihetta: näytteen keittäminen ja epäpuhtauksien adsorptio ioninvaihtimessa. Menetelmä on erittäin houkutteleva toteuttamisen yksinkertaisuuden vuoksi. Useimmissa tapauksissa se sopii työskentelyyn kliinisen materiaalin kanssa. Valitettavasti joskus näytteissä on epäpuhtauksia, joita ei voida poistaa ioninvaihtimilla. Lisäksi joitain mikro-organismeja ei voida tuhota yksinkertaisella keittämällä. Näissä tapauksissa on tarpeen ottaa käyttöön lisävaiheita näytteen käsittelyyn.

Näin ollen näytteen valmistusmenetelmän valintaa tulisi käsitellä suunniteltujen analyysien tavoitteiden ymmärtämisellä.

1.5.6 Vahvistus

Monistusreaktion suorittamiseksi on tarpeen valmistaa reaktioseos ja lisätä siihen analysoitu DNA-näyte. Tässä tapauksessa on tärkeää ottaa huomioon joitain alukkeen hehkutuksen ominaisuuksia. Tosiasia on, että analysoitavassa biologisessa näytteessä on pääsääntöisesti erilaisia ​​DNA-molekyylejä, joihin reaktiossa käytetyillä alukkeilla on osittainen ja joissakin tapauksissa merkittävä homologia. Lisäksi alukkeet voivat liittyä toisiinsa muodostaen aluke-dimeerejä. Molemmat johtavat merkittävään alukkeiden kulutukseen sivureaktiotuotteiden (epäspesifisten) synteesiin ja sen seurauksena heikentävät merkittävästi järjestelmän herkkyyttä. Tämä tekee reaktion tulosten lukemisen elektroforeesin aikana vaikeaksi tai mahdottomaksi.

1.6 Standardin PCR-reaktioseoksen koostumus

x PCR-puskuri (100 mM Tris-HCl-liuos, pH 9,0, 500 mM KCl-liuos, 25 mM MgCl2-liuos ) …….2,5 µl

Vesi (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotiditrifosfaattien (dNTP) seos

mM liuos jokaisesta………………………………………….……….0,5 µl

Aluke 1 (10 mM liuos) ……………………………………………….….1 µl

Aluke 2 (10 mM liuos) …………………………………………….….1 µl

DNA-polymeraasi (5 yksikköä / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNA-näyte (20 ng/µl) ………………………………………………..1 µl

1.7 Reaktiotulosten arviointi

Jotta PCR-tulokset voidaan arvioida oikein, on tärkeää ymmärtää, että tämä menetelmä ei ole kvantitatiivinen. Teoriassa yksittäisten kohde-DNA-molekyylien monistustuotteet voidaan havaita elektroforeesilla jo 30–35 syklin jälkeen. Käytännössä tämä tehdään kuitenkin vain tapauksissa, joissa reaktio tapahtuu lähellä ihanteellisia olosuhteita, mitä elämässä ei usein tapahdu. DNA-valmisteen puhtausasteella on erityisen suuri vaikutus monistuksen tehokkuuteen; tiettyjen inhibiittorien läsnäolo reaktioseoksessa, joista voi joissain tapauksissa olla erittäin vaikea päästä eroon. Joskus niiden läsnäolon vuoksi ei ole mahdollista monistaa jopa kymmeniä tuhansia kohde-DNA-molekyylejä. Siten ei useinkaan ole suoraa yhteyttä kohde-DNA:n alkuperäisen määrän ja monistustuotteiden lopullisen määrän välillä.

Luku 2: Polymeraasiketjureaktion sovellukset

PCR:ää käytetään monilla aloilla analyyseihin ja tieteellisiin kokeisiin.

Kriminalistiikka

PCR:ää käytetään niin kutsuttujen "geneettisten sormenjälkien" vertailuun. Tarvitsemme näytteen geneettisestä materiaalista rikospaikalta - verta, sylkeä, siemennestettä, hiuksia jne. Sitä verrataan epäillyn geneettiseen materiaaliin. Hyvin pieni määrä DNA:ta riittää, teoriassa - yksi kopio. DNA leikataan fragmenteiksi ja monistetaan sitten PCR:llä. Fragmentit erotetaan DNA-elektroforeesilla. Syntynyttä kuvaa DNA-juovien sijainnista kutsutaan geneettiseksi sormenjäljeksi.

Isyyden vahvistaminen

PCR:llä monistettujen DNA-fragmenttien elektroforeesin tulokset. Isä. Lapsi. Äiti. Lapsi peri joitain piirteitä molempien vanhempien geneettisestä jäljestä, mikä antoi uuden, ainutlaatuisen jäljen.

Vaikka "geneettiset sormenjäljet" ovat ainutlaatuisia, perhesiteet voidaan silti muodostaa tekemällä useita tällaisia ​​sormenjälkiä. Samaa menetelmää voidaan soveltaa pienin muutoksin evoluutiosuhteiden luomiseen organismien välillä.

Lääketieteellinen diagnostiikka

PCR mahdollistaa perinnöllisten ja virusperäisten sairauksien diagnosoinnin merkittävästi nopeuttamisen ja helpon. Kiinnostuksen kohteena oleva geeni monistetaan PCR:llä käyttäen sopivia alukkeita ja sekvensoidaan sitten mutaatioiden määrittämiseksi. Virusinfektiot voidaan havaita heti tartunnan jälkeen, viikkoja tai kuukausia ennen taudin oireiden ilmaantumista.

Henkilökohtainen lääketiede

Joskus lääkkeet ovat myrkyllisiä tai allergiaa aiheuttavia joillekin potilaille. Syynä tähän ovat osittain yksilölliset erot lääkkeiden ja niiden johdannaisten herkkyydessä ja metaboliassa. Nämä erot määräytyvät geneettisellä tasolla. Esimerkiksi yhdellä potilaalla tietty sytokromi voi olla aktiivisempi, toisessa - vähemmän. Sen määrittämiseksi, millainen sytokromi tietyllä potilaalla on, ehdotetaan PCR-analyysin suorittamista ennen lääkkeen käyttöä. Tätä analyysiä kutsutaan alustavaksi genotyypitykseksi.

Geenikloonaus

Geenikloonaus on prosessi, jossa geenit eristetään ja geenitekniikan manipulaatioiden seurauksena saadaan suuri määrä tietyn geenin tuotetta. PCR:llä monistetaan geeni, joka sitten liitetään vektoriin, DNA-palaan, joka kuljettaa vieraan geenin samaan organismiin, tai toiseen organismiin, jota on helppo kasvattaa. Vektoreina käytetään esimerkiksi plasmideja tai virus-DNA:ta. Geenien lisäämistä vieraaseen organismiin käytetään yleensä tämän geenin tuotteen - RNA:n tai useimmiten proteiinin - saamiseksi. Tällä tavalla saadaan monia proteiineja teollisina määrinä käytettäväksi maataloudessa, lääketiede jne.

DNA-sekvensointi

Fluoresoivasti tai radioaktiivisesti leimattuja dideoksinukleotideja käyttävässä sekvensointimenetelmässä PCR on olennainen osa, koska juuri polymeroinnin aikana DNA-ketjuun liitetään fluoresoivalla tai radioaktiivisella leimalla leimattuja nukleotidijohdannaisia. Tämä pysäyttää reaktion, jolloin spesifisten nukleotidien paikat voidaan määrittää syntetisoitujen juosteiden erottamisen jälkeen geelissä.

Mutageneesi

Tällä hetkellä PCR:stä on tullut tärkein mutageneesimenetelmä. PCR:n käyttö mahdollisti mutageneesimenettelyn yksinkertaistamisen ja nopeuttamisen sekä sen luotettavuuden ja toistettavuuden.

PCR-menetelmä mahdollisti ihmisen papilloomavirussekvenssien läsnäolon analysoinnin parafiiniin upotetuista ihmisen kohdunkaulan kasvaimista otettujen biopsioiden osissa 40 vuotta ennen tätä tutkimusta. Lisäksi PCR:n avulla oli mahdollista monistaa ja kloonata mitokondrioiden DNA-fragmentteja 7 tuhatta vuotta vanhoista ihmisaivojen fossiilisista jäännöksistä!

Yksittäisten ihmisen siittiöiden lysaateissa osoitettiin mahdollisuus analysoida samanaikaisesti kahta eri ei-homologisissa kromosomeissa sijaitsevia lokuksia. Tämä lähestymistapa tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden hienoon geneettiseen analyysiin ja kromosomaalisen rekombinaation, DNA-polymorfismin jne. tutkimukseen. Yksittäisten siittiöiden analysointimenetelmä löydettiin välittömästi käytännön käyttöä oikeuslääketieteessä, koska haploidisten solujen HLA-tyypitys mahdollistaa isyyden määrittämisen tai rikollisen tunnistamisen (HLA-kompleksi on joukko ihmisen suuriaeenejä; HLA-kompleksin lokukset ovat polymorfisimpia kaikista korkeammissa selkärankaisissa tunnetuista: sisällä kussakin lokuksessa on epätavallisen suuri määrä erilaisia ​​alleeleja - saman geenin vaihtoehtoisia muotoja).

PCR:n avulla on mahdollista paljastaa vieraiden geneettisten rakenteiden integraation oikeellisuus tutkittujen solujen genomin ennalta määrätylle alueelle. Solun kokonais-DNA paritetaan kahdella oligonukleotidialukkeella, joista toinen on komplementaarinen isäntä-DNA-alueelle lähellä insertiokohtaa ja toinen antiparallelisessa DNA-juosteessa olevan integroidun fragmentin sekvenssin kanssa. Polymeraasiketjureaktio, jos kromosomin DNA:n rakenne on muuttumaton ehdotetussa insertiokohdassa, johtaa määrittelemättömän kokoisten yksijuosteisten DNA-fragmenttien muodostumiseen ja suunnitellussa insertiossa tunnetun kaksijuosteisten DNA-fragmenttien muodostumiseen. koko, joka määräytyy kahden alukkeen pariutumiskohtien välisen etäisyyden perusteella. Lisäksi genomin analysoidun alueen monistumisaste on ensimmäisessä tapauksessa lineaarisesti riippuvainen syklien lukumäärästä ja toisessa - eksponentiaalisesti. Ennalta määrätyn kokoisen monistetun fragmentin eksponentiaalinen kerääntyminen PCR:n aikana mahdollistaa sen visuaalisen havainnoinnin DNA-valmisteen elektroforeettisen fraktioinnin jälkeen ja tekee yksiselitteisen johtopäätöksen vieraan sekvenssin liittämisestä tietylle kromosomaalisen DNA:n alueelle.

Johtopäätös

PCR-menetelmä on tällä hetkellä yleisimmin käytetty menetelmä erilaisten tartuntatautien diagnosoinnissa. PCR:n avulla voit tunnistaa infektion etiologian, vaikka analysoitavaksi otettu näyte sisältäisi vain muutaman taudinaiheuttajan DNA-molekyylin. PCR:ää käytetään laajalti HIV-infektioiden, virushepatiitin jne. varhaisessa diagnosoinnissa. Toistaiseksi ei ole olemassa juuri yhtään tartunnanaiheuttajaa, jota ei voida havaita PCR:llä.

Luettelo käytetystä kirjallisuudesta

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Molekyyli-geneettisen analyysin menetelmät. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 s.

2.PCR "reaaliajassa" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. jne.; toim. b. n. D.V. Rebrikov; esipuhe LA. Osterman ja akad. RAS ja RAAS E.D. Sverdlov; 2. painos, rev. ja ylimääräisiä - M.: BINOM. Knowledge Laboratory, 2009. - 223 s.

.Patrushev L.I. Keinotekoiset geneettiset järjestelmät. - M.: Nauka, 2005. - 2 tonnia

.B. Glick, J. Pasternak Molecular biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen 589 sivua, 2002

5.Shchelkunov S.N. geenitekniikka. - Novosibirsk: Sib. univ. kustantamo, 2004. - 496 s.

Toimittaja A.A. Vorbjeva "Polymeraasiketjureaktio ja sen sovellus dermatovenereologian diagnostiikkaan"; Lääketieteen uutistoimisto - 72 sivua

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - lääketieteellinen päiväkirja

Tutorointi

Tarvitsetko apua aiheen oppimisessa?

Asiantuntijamme neuvovat tai tarjoavat tutorointipalveluita sinua kiinnostavista aiheista.
Lähetä hakemus ilmoittamalla aiheen juuri nyt saadaksesi selville mahdollisuudesta saada konsultaatio.

Riittävälle ja tehokas hoito monet tartuntataudit vaativat ajoissa havaitsemista tarkka diagnoosi. Tämän ongelman ratkaisemisessa nykyään käytetään korkean teknologian diagnostisia menetelmiä, jotka perustuvat molekyylibiologian menetelmiin. Tällä hetkellä polymeraasiketjureaktiota (PCR) käytetään jo laajalti käytännön lääketieteessä luotettavimpana laboratoriodiagnostiikkatyökaluna.

Mikä selittää PCR:n suosion tällä hetkellä?

Ensinnäkin tätä menetelmää käytetään erilaisten tartuntatautien patogeenien tunnistamiseen suurella tarkkuudella.

Toiseksi seurata hoidon tehokkuutta.

Erilaisissa käsikirjoissa, esitteissä, artikkeleissa sekä erikoislääkäreiden selityksissä kohtaamme usein käsittämättömien termien ja sanojen käyttöä. Tieteen korkean teknologian tuotteista on todella vaikea puhua tavallisin sanoin.

Mikä on PCR-diagnostiikan ydin ja mekaniikka?

Jokaisella elävällä organismilla on omat ainutlaatuiset geeninsä. Geenit sijaitsevat DNA-molekyylissä, joka itse asiassa on kunkin tietyn organismin "käyntikortti". DNA (geneettinen materiaali) on erittäin pitkä molekyyli, joka koostuu nukleotideiksi kutsutuista rakennuspalikoista. Jokaiselle tartuntatautien patogeenille ne sijaitsevat tiukasti spesifisesti, eli tietyssä järjestyksessä ja yhdistelmässä. Kun on tarpeen ymmärtää, onko henkilöllä tietty taudinaiheuttaja, otetaan biologista materiaalia (veri, virtsa, sylki, sivelynäyte), joka sisältää mikrobin DNA:ta tai DNA-fragmentteja. Mutta patogeenin geneettisen materiaalin määrä on hyvin pieni, ja on mahdotonta sanoa, mihin mikro-organismiin se kuuluu. Tämän ongelman ratkaisemiseksi PCR palvelee. Polymeraasiketjureaktion ydin on, että DNA:ta sisältävää tutkimusmateriaalia otetaan pieni määrä, ja PCR-prosessin aikana tiettyyn taudinaiheuttajaan kuuluvan geneettisen materiaalin määrä kasvaa ja siten se voidaan tunnistaa.

PCR-diagnostiikka on biomateriaalin geneettinen tutkimus.

PCR-menetelmän idea kuuluu amerikkalaiselle tiedemiehelle K. Mullinsille, jonka hän ehdotti vuonna 1983. Se sai kuitenkin laajan kliinisen käytön vasta XX vuosisadan 90-luvun puolivälissä.

Käsitellään terminologiaa, mitä se on - DNA jne. Jokaisen elävän olennon (eläin, kasvi, ihminen, bakteeri, virus) jokaisessa solussa on kromosomit. Kromosomit ovat geneettisen tiedon säilyttäjiä, jotka sisältävät kunkin elävän olennon koko geenisekvenssin.

Jokainen kromosomi koostuu kahdesta DNA-säikeestä, jotka on kierretty kierteeksi suhteessa toisiinsa. DNA on kemiallisesti deoksiribonukleiinihappoa, joka koostuu rakenteellisista komponenteista - nukleotideista. Nukleotideja on 5 tyyppiä - tymiini (T), adenosiini (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja urasiili (U). Nukleotidit järjestyvät peräkkäin tiukkaan yksittäisen sekvenssin muodostaen geenejä. Yksi geeni voi koostua 20-200 sellaisesta nukleotidista. Esimerkiksi insuliinin tuotantoa koodaava geeni on 60 emäsparia pitkä.

Nukleotideilla on komplementaarisuuden ominaisuus. Tämä tarkoittaa, että toisessa DNA-juosteessa vastakkaista adeniinia (A) on aina toisessa juosteessa tymiini (T) ja guaniinia (G) vastapäätä - sytosiini (C). Kaavamaisesti näyttää tältä:
G-C
T-A
A-T
Tämä täydentävyysominaisuus on avain PCR:lle.

DNA:n lisäksi RNA:lla on sama rakenne - ribonukleiinihappo, joka eroaa DNA:sta siinä, että se käyttää urasiilia tymiinin sijaan. RNA - on geneettisen tiedon säilyttäjä joissakin viruksissa, joita kutsutaan retroviruksiksi (esimerkiksi HIV).

DNA- ja RNA-molekyylit voivat "lisätä" (tätä ominaisuutta käytetään PCR:ssä). Tämä tapahtuu seuraavasti: kaksi DNA- tai RNA-säiettä siirtyy pois toisistaan ​​​​sivuille, jokaisessa langassa istuu erityinen entsyymi, joka syntetisoi uuden ketjun. Synteesi etenee komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti, eli jos nukleotidi A on alkuperäisessä DNA-ketjussa, niin T on vastikään syntetisoidussa, jos G - sitten C jne. Tämä erityinen "rakennusentsyymi" tarvitsee "siemenen" - 5-15 nukleotidin sekvenssin - aloittaakseen synteesin. Tämä "siemen" on määritelty jokaiselle geenille (klamydiageeni, mykoplasmat, virukset) kokeellisesti.

Joten jokainen PCR-sykli koostuu kolmesta vaiheesta. Ensimmäisessä vaiheessa tapahtuu niin sanottu DNA:n purkaminen eli kahden toisiinsa kytketyn DNA-juosteen erottaminen. Toisessa "siemen" on kiinnitetty DNA-juosteen osaan. Ja lopuksi näiden DNA-säikeiden pidentyminen, jonka "rakentaja"-entsyymi tuottaa. Tällä hetkellä kaikki tämä vaikea prosessi etenee yhdessä koeputkessa ja koostuu määritetyn DNA:n toistuvista toistosykleistä, jotta saadaan suuri määrä kopioita, jotka voidaan sitten havaita tavanomaisilla menetelmillä. Eli yhdestä DNA-juosteesta saamme satoja tai tuhansia.

PCR-tutkimuksen vaiheet

Biologisen materiaalin kokoelma tutkimusta varten

Näytteenä toimii erilaisia ​​biologisia aineita: veri ja sen komponentit, virtsa, sylki, limakalvot, aivo-selkäydinneste, vuoto haavapinnat, kehon onteloiden sisältö. Kaikki bionäytteet kerätään kertakäyttöisillä instrumenteilla ja kerätty materiaali laitetaan steriileihin muoviputkiin tai asetetaan viljelyalustaan, minkä jälkeen kuljetetaan laboratorioon.

Tarvittavat reagenssit lisätään otettuihin näytteisiin ja asetetaan ohjelmoitavaan termostaattiin - lämpökiertolaitteeseen (vahvistimeen). Cylerissa PCR-sykli toistetaan 30-50 kertaa, ja se koostuu kolmesta vaiheesta (denaturaatio, hehkutus ja pidennys). Mitä tämä tarkoittaa? Tarkastellaanpa tarkemmin.

Välittömän PCR-reaktion vaiheet, geneettisen materiaalin kopiointi

minäPCR-vaihe - Geneettisen materiaalin valmistelu kopiointia varten.
Esiintyy 95 ° C:n lämpötilassa, kun taas DNA-säikeet irrotetaan ja "siemenet" voivat istua niissä.

"Siemeniä" valmistavat teollisesti eri tutkimus- ja tuotantoyhdistykset, ja laboratoriot ostavat valmiita. Samaan aikaan esimerkiksi klamydian havaitsemiseen tarkoitettu "siemen" toimii vain klamydian jne. Siten, jos biomateriaalia testataan klamydiainfektion esiintymisen varalta, reaktioseokseen laitetaan klamydian "siemen"; jos testataan biomateriaalia Epstein-Barr-viruksen varalta, niin "siemen" Epstein-Barr-virukselle.

IIvaihe - Yhdistetään tartunnanaiheuttajan ja "siemenen" geneettinen materiaali.
Jos viruksen tai bakteerin DNA:ta on määritettävä, "siemen" on tämän DNA:n päällä. Tämä alukkeen lisäysprosessi on PCR:n toinen vaihe. Tämä vaihe tapahtuu 75 °C:n lämpötilassa.

IIIvaihe - Kopioidaan tartunnanaiheuttajan geneettinen materiaali.
Tämä on geneettisen materiaalin varsinainen pidentyminen tai lisääntyminen, joka tapahtuu 72 °C:ssa. Entsyymirakentaja lähestyy "siemeniä" ja syntetisoi uuden DNA-juosteen. Uuden DNA-juosteen synteesin päättyessä myös PCR-sykli päättyy. Eli yhdessä PCR-syklissä geneettisen materiaalin määrä kaksinkertaistuu. Esimerkiksi alkuperäisessä näytteessä oli 100 viruksen DNA-molekyyliä, ensimmäisen PCR-syklin jälkeen näyte sisältää jo 200 testatun viruksen DNA-molekyyliä. Yksi sykli kestää 2-3 minuuttia.

Riittävän geneettisen materiaalin tuottamiseksi tunnistusta varten suoritetaan yleensä 30-50 PCR-sykliä, mikä kestää 2-3 tuntia.

Lisätyn geneettisen materiaalin tunnistamisvaihe

Itse PCR päättyy tähän ja sitten tulee yhtä merkittävä tunnistusvaihe. Tunnistamiseen käytetään elektroforeesia tai merkittyjä "siemeniä". Elektroforeesia käytettäessä saadut DNA-säikeet erotetaan koon mukaan, ja eripituisten DNA-fragmenttien läsnäolo osoittaa positiivisen analyysin tuloksen (eli tietyn viruksen, bakteerin jne. läsnäoloa). Merkittyjä "siemeniä" käytettäessä reaktion lopputuotteeseen lisätään kromogeenia (väriainetta), minkä seurauksena entsymaattiseen reaktioon liittyy värin muodostuminen. Värin kehittyminen osoittaa suoraan, että alkuperäisessä näytteessä on virus tai muu havaittava aine.

Tähän mennessä on mahdollista "lukea" PCR-tulokset välittömästi käyttämällä merkittyjä "siemeniä" sekä asianmukaista ohjelmistoa. Tämä on niin kutsuttu reaaliaikainen PCR.

Miksi PCR-diagnostiikka on niin arvokasta?

Yksi PCR-menetelmän merkittävistä eduista on sen korkea herkkyys - 95 - 100%. Näiden etujen on kuitenkin perustuttava seuraavien ehtojen välttämättömään noudattamiseen:

1. oikea näytteenotto, biologisen materiaalin kuljetus;
2. steriilien, kertakäyttöisten instrumenttien, erityisten laboratorioiden ja koulutetun henkilöstön saatavuus;
3. menetelmän tiukka noudattaminen ja steriiliys analyysin aikana

Herkkyys vaihtelee havaittujen mikrobien mukaan. Joten esimerkiksi PCR-menetelmän herkkyys hepatiitti C-viruksen havaitsemiseksi on 97-98%, herkkyys ureaplasman havaitsemiseksi on 99-100%.

PCR-analyysin luontaiset ominaisuudet mahdollistavat ylittämättömän analyyttisen spesifisyyden saavuttamisen. Tämä tarkoittaa, että tunnistetaan täsmälleen se mikro-organismi, jota etsittiin, ei samankaltaista tai läheistä sukua olevaa mikro-organismia.
Diagnostinen herkkyys ja PCR-menetelmän spesifisyys ylittävät usein viljelymenetelmän, jota kutsutaan "kultastandardiksi" tartuntatautien havaitsemisessa. Kun otetaan huomioon viljelmän kasvun kesto (useita päiviä useisiin viikkoihin), PCR-menetelmän etu tulee ilmeiseksi.

PCR infektioiden diagnosoinnissa
PCR-menetelmän edut (herkkyys ja spesifisyys) määrittävät laajan valikoiman sovelluksia nykyaikaisessa lääketieteessä.
PCR-diagnostiikan tärkeimmät sovellusalueet:

1. eri lokalisaatioiden akuuttien ja kroonisten tartuntatautien diagnosointi
2. seurata hoidon tehokkuutta
3. patogeenin tyypin selvittäminen

PCR:ää käytetään synnytystautien, gynekologian, neonatologian, pediatrian, urologian, sukupuolitautien, nefrologian, infektiotautiklinikan, oftalmologian, neurologian, fthisiopulmonologian jne.

PCR-diagnostiikan käyttö tapahtuu muiden tutkimusmenetelmien (ELISA, PIF, RIF jne.) yhteydessä. Niiden yhdistelmän ja tarkoituksenmukaisuuden päättää hoitava lääkäri.

PCR:llä havaitut tartunnanaiheuttajat

Virukset:

1. HIV-1 ja HIV-2 retrovirukset
2. herpetiformiset virukset
3. virus huuliherpes 1 ja 2 tyyppiä

Viime aikoina luotettava, erittäin herkkä ja nopea menetelmä ihmisten erilaisten tartuntatautien diagnosointi. Tätä menetelmää kutsutaan "PCR-analyysiksi". Mikä se on, mikä on sen olemus, mitä mikro-organismeja se voi paljastaa ja miten se otetaan oikein, kerromme artikkelissamme.

Löytöhistoria

PCR-menetelmiä käytetään myös syövän diagnosoinnissa.

Menetelmän edut

PCR-diagnostiikassa on useita etuja:

1. Yliherkkyys. Jopa vain muutaman mikro-organismi-DNA-molekyylin läsnä ollessa, PCR-analyysi määrittää infektion olemassaolon. Menetelmä auttaa kroonisten ja piilevien sairauksien hoidossa. Usein tällaisissa tapauksissa mikro-organismi on muuten viljelemätön.
2. Tutkimukseen soveltuu mikä tahansa materiaali, esimerkiksi sylki, veri, sukuelinten eritteet, hiukset, epiteelisolut. Yleisin on verikoe ja urogenitaalinäyte PCR:ää varten.

   

3. Kasvien pitkäaikaista viljelyä ei vaadita. Automatisoidun diagnoosiprosessin avulla voit saada tutkimuksen tulokset 4-5 tunnin kuluttua.
4. Menetelmä on lähes 100 % luotettava. Vain yksittäisiä vääriä negatiivisia tuloksia on kirjattu.
5. Mahdollisuus tunnistaa useita taudinaiheuttajia yhdestä materiaalinäytteestä. Tämä ei vain nopeuttaa taudin diagnosointia, vaan myös vähentää merkittävästi materiaalikustannuksia. Usein lääkäri määrää kattavan PCR-analyysin. Tutkimuksen hinta, joka koostuu kuuden taudinaiheuttajan määrittämisestä, on noin 1500 ruplaa.

Jotta tulokset olisivat luotettavia PCR-tutkimuksen aikana, on välttämätöntä läpäistä analyysi noudattaen suosituksia diagnoosin alustavasta valmistelusta:

1. Ennen syljen luovuttamista tulee pidättäytyä syömästä ja ottamasta lääkkeitä 4 tuntia ennen aineen ottamista. Huuhtele suusi keitetyllä vedellä välittömästi ennen toimenpidettä.
2. Yllä olevia sääntöjä tulee noudattaa myös otettaessa näyte posken sisäpinnalta. Huuhtelun jälkeen on suositeltavaa suorittaa kevyt ihohieronta rauhasen salaisuuden korostamiseksi.
3. Virtsa kerätään yleensä kotona. Tätä varten sinun on suoritettava sukupuolielinten perusteellinen wc. Kerää 50-60 ml virtsaa steriiliin muoviastiaan. Materiaalin puhtauden varmistamiseksi on suositeltavaa, että naiset laittavat tamponin emättimeen ja miehillä vedetään ihopoimu mahdollisimman pitkälle. Et voi ottaa materiaalia kuukautisten aikana.
4. Siittiöiden luovuttamista varten sinun on pidättäydyttävä seksistä 3 päivää ennen materiaalin keräämistä. Lääkärit neuvovat myös olemaan saunassa ja kuumassa kylvyssä, juomatta alkoholia ja mausteista ruokaa. 3 tuntia ennen analyysiä sinun on pidättäydyttävä virtsaamasta.
5. Esimerkiksi synnytyksen yhteydessä, jos PCR-testi tehdään klamydian varalta, sekä naisille että miehille suositellaan 3 päivän seksuaalista lepoa. Antibakteerisia lääkkeitä ei pidä ottaa 2 viikkoa ennen analyysiä. Viikon ajaksi sinun on lopetettava intiimigeelien, voiteiden, emättimen peräpuikkojen, douchingin käyttö. 3 tuntia ennen tutkimusta on pidättäydyttävä virtsaamasta. Kuukautisten aikana materiaalia ei oteta, vain 3 päivää verenvuodon päättymisen jälkeen voit ottaa urogenitaalinäytteen.

PCR raskauden aikana

Vauvan odotusaikana monet sukupuoliteitse tarttuvat tartuntataudit ovat erittäin vaarallisia normaalia kehitystä sikiö. Sukupuolitaudit voivat aiheuttaa kohdunsisäistä kasvun hidastumista, keskenmenoa tai ennenaikaista synnytystä, lapsen synnynnäisiä epämuodostumia. Siksi on erittäin tärkeää mennä aikaiset päivämäärät raskaustutkimus PCR:llä. Analyysi on läpäistävä rekisteröinnin yhteydessä - enintään 12 viikkoa.



Materiaali otetaan kohdunkaulan kanavasta erityisellä harjalla. Toimenpide on kivuton eikä aiheuta vaaraa vauvalle. Yleensä raskauden aikana analysoidaan klamydia PCR-menetelmällä, samoin kuin ureaplasmoosi, mykoplasmoosi, sytomegalovirus, herpes, papilloomavirus. Tällaista tutkimuskompleksia kutsutaan PCR-6:ksi.

PCR HIV-diagnoosia varten

Koska menetelmä on erittäin herkkä kehon muutoksille ja diagnoosin olosuhteille, monet tekijät voivat vaikuttaa tulokseen. Siksi HIV-infektion PCR-analyysi ei ole luotettava menetelmä, sen tehokkuus on 96-98%. Loput 2-4 % tapauksista testi antaa vääriä positiivisia tuloksia.

Mutta joissakin tilanteissa ei voi tulla toimeen ilman HIV:n PCR-diagnostiikkaa. Sitä annetaan yleensä ihmisille, joiden ELISA-tulos on väärä. Tällaiset indikaattorit osoittavat, että henkilö ei ole vielä kehittänyt vasta-aineita virukselle, eikä niitä voida havaita ilman moninkertaista määrän kasvua. Juuri tämä voidaan saavuttaa tekemällä verikoe PCR-menetelmällä.

Tällainen diagnostiikka on tarpeen myös ensimmäisen elinvuoden lapsille, jotka ovat syntyneet HIV-positiivisesta äidistä. Menetelmä on ainoa tapa lapsen aseman luotettava määrittäminen.

PCR hepatiitin diagnosointiin

Polymeraasiketjureaktiomenetelmä mahdollistaa A-, B-, C-hepatiittiviruksen DNA:n havaitsemisen kauan ennen infektion vasta-aineiden muodostumista tai taudin oireiden alkamista. Hepatiitti C:n PCR-analyysi on erityisen tehokas, koska 85 prosentissa tapauksista tämä sairaus on oireeton ja ilman oikea-aikaista hoitoa siirtyy krooniseen vaiheeseen.



Patogeenin oikea-aikainen havaitseminen auttaa välttämään komplikaatioita ja pitkäaikaista hoitoa.

Kattava PCR-tutkimus

Kattava PCR-analyysi: tutkimus polymeeriketjureaktiomenetelmällä, joka sisältää useiden infektiotyyppien määrittämisen samanaikaisesti: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, Trichomonas, sytomegalovirus, herpes tyypit 1 ja 2, gonorrea, papilloomavirus. Tällaisen diagnostiikan hinta vaihtelee 2000 - 3500 ruplaa. riippuen klinikasta, käytetyistä materiaaleista ja laitteista sekä analyysin tyypistä: kvalitatiivinen tai määrällinen. Mitä sinun tapauksessasi tarvitaan - lääkäri päättää. Joissakin tapauksissa riittää vain patogeenin läsnäolon määrittäminen, toisissa, esimerkiksi HIV-tartunnan yhteydessä, kvantitatiivisella tiitterillä on tärkeä rooli. Kun diagnosoidaan kaikki edellä mainitut patogeenit, tutkimusta kutsutaan "PCR-12-analyysiksi".

Analyysin tulosten purkaminen

PCR-analyysin purkaminen ei ole vaikeaa. Indikaattorissa on vain 2 asteikkoa - " positiivinen tulos" ja "negatiivinen tulos". Kun taudinaiheuttaja havaitaan, lääkärit voivat vahvistaa taudin olemassaolon 99 %:n varmuudella ja aloittaa potilaan hoidon. Kvantitatiivisella menetelmällä tartunnan määrittämiseksi vastaava sarake osoittaa havaittujen bakteerien numeerisen indikaattorin. Vain lääkäri voi määrittää taudin asteen ja määrätä tarvittavan hoidon.



Joissakin tapauksissa, esimerkiksi määritettäessä HIV-infektio PCR:llä, negatiivisella tuloksella, on tarpeen suorittaa lisätutkimuksia saatujen indikaattorien vahvistamiseksi.

Mistä analyysi viedään?

Mistä PCR-analyysi otetaan: julkisella klinikalla vai yksityisessä laboratoriossa? Valitettavasti kunnallisissa hoitolaitoksissa laitteet ja menetelmät ovat usein vanhentuneita. Siksi on parempi antaa etusija yksityisille laboratorioille, joissa on nykyaikaiset laitteet ja korkeasti koulutettu henkilökunta. Lisäksi yksityisellä klinikalla saat tuloksia paljon nopeammin.

Moskovassa monet yksityiset laboratoriot tarjoavat PCR-analyysejä erilaisille infektioille. Esimerkiksi sellaisilla klinikoilla kuin Vita, Complex Clinic, Happy Family, Uro-Pro, PCR-analyysi suoritetaan. Tutkimuksen hinta on alkaen 200 ruplaa. yksittäisen patogeenin tunnistamiseen.

Voidaan päätellä, että tartuntatautien diagnosointi PCR:llä on useimmissa tapauksissa nopea ja luotettava tapa havaita taudinaiheuttaja elimistössä infektion varhaisessa vaiheessa. Mutta silti tietyissä tapauksissa kannattaa valita muita diagnostisia menetelmiä. Vain asiantuntija voi määrittää tällaisen tutkimuksen tarpeen. PCR-analyysin purkaminen vaatii myös ammattimaista lähestymistapaa. Noudata lääkärisi ohjeita äläkä ota testejä, joita et tarvitse.