Извършването на PCR анализ (PCR диагностика) започва с вземането на материал за изследване от гинеколог, уролог или дерматовенеролог. Качеството и надеждността на получените впоследствие резултати се осигурява от най-високата квалификация и богатия опит на лекарите от медицински център Евромедпрестиж, които спазват всички необходими правила провеждане на PCR- анализ: пълна стерилност, използване само на материали за еднократна употреба.

Събраният материал от четката се поставя в съд с физиологичен разтвор. След вземането пробите трябва да бъдат доставени в PCR лабораторията възможно най-скоро.

PCR анализът се извършва в лабораторията на три етапа:

1. Екстракция на ДНК
2. Амплификация на ДНК фрагменти
3. Откриване на продукти на ДНК амплификация

Извличането на ДНК е началният етап на PCR диагностиката, чиято същност е следната: лекарят взема материал за изследване от пациента и го подлага на специална обработка. По време на обработката двойната спирала на ДНК се разделя на отделни нишки. Към материала на пациента се добавя специална течност, която разтваря органични вещества, които пречат на "чистотата" на реакцията. Това премахва липидите, аминокиселините, пептидите, въглехидратите, протеините и полизахаридите. В резултат на това се образува ДНК или РНК.

Принципът на PCR метода е „конструирането“ на нови ДНК или РНК инфекции. Това не може да стане без отстраняване на клетъчния материал.

Времето, необходимо за извличане на ДНК, зависи от причинителя на инфекцията и от вида на материала, използван за PCR изследване. Например, подготовката на кръвта за следващия етап отнема 1,5-2 часа.

0Масив ( => Анализи) Масив ( => 2) Масив ( =>.html) 2

ДНК амплификация

За да извършат следващия етап от ДНК диагностиката - ДНК амплификация - лекарите използват така наречените ДНК матрици - ДНК молекули на инфекции, върху които впоследствие ще се извърши "клониране" на ДНК. Вече беше споменато, че не е необходимо наличието на пълната ДНК на инфекцията, за осъществяването на този етап е достатъчно малко парче от ДНК молекулата, което е характерно само за даден микроб (инфекция).

Основата на амплификацията на ДНК и съответно основата на целия принцип на PCR реакцията е естественият процес на завършване на ДНК за всички живи същества - репликация на ДНК, която се осъществява чрез удвояване на една единствена ДНК верига.

Започвайки с един единствен фрагмент от ДНК, лабораторният лекар го копира и увеличава броя на копията в режим на верижна реакция: след първия цикъл вече имате 2 фрагмента, след втория цикъл - 4, след третия - 8, след четвърти - 16, след това 32, 64, 128, 256... С всеки цикъл броят на копията се удвоява и след двадесет цикъла броят вече отива в милиони, а след тридесет - в милиарди. Цикълът продължава няколко минути и се свежда до определена промяна в температурата в много малък химически реактор. Тук, в разтвора, всички необходими компоненти на синтеза присъстват в достатъчни количества, на първо място, нуклеотиди A, G, T и C, а също така се извършват деликатни подготвителни химични операции, така че веднага да се вземе точно копие от всеки завършен ДНК сегмент, след това от това копие - отново копие, това е разклонената верижна реакция.

Чрез прикрепване на праймери към ДНК веригата - изкуствено синтезирани "парчета" ДНК (нуклеотидни двойки), подобни на ДНК на микроби (инфекции) - се образуват две къси спирали, състоящи се от две вериги на ДНК участъци, които са необходими за синтеза на бъдещи ДНК.

Синтезът на нова верига възниква чрез завършване на всяка от двете ДНК вериги. Процесът на амплификация се осъществява с помощта на специфична област - ДНК полимераза, която дава името на лабораторния метод. Полимеразата действа като катализатор за реакцията и наблюдава последователното прикрепване на нуклеотидни бази към растящата нова ДНК верига.

По този начин амплификацията на ДНК е многократно увеличаване на броя на ДНК копията, които са специфични, т.е. присъщи само на определен организъм. Не е необходимо да се завърши цялата ДНК верига, за да се види инфекциозният агент. Необходима е само зоната, която е характерна за дадена бактерия като индивид.

5360 рубли. Цената на цялостна програма с гастроентеролог

ОТСТЪПКА 25% НА ЗАПИСВАНЕ НА ЧАС ПРИ КАРДИОЛОГ

- 25%първичен
Посещение на лекар
терапевт през почивните дни

5160 рубли вместо 5420 rub. Скрининг на мъжете за урологични инфекции

АЛЕРГОЛОГИЯ 5120 рубли вместо 5590 rub.

Всички силно повтарящи се етапи на усилване се случват при различни температури. За извършване на PCR анализ се използва специално програмируемо оборудване - PCR - термостат или усилвател, който автоматично променя температурите. Амплификацията се извършва по зададена програма, съответстваща на вида на откритата инфекция. В зависимост от програмата и вида на откритата инфекция, автоматизираният PCR процес отнема от 2 до 3 часа.

Важна роля в PCR диагностиката играе квалификацията на лабораторния лекар, който извършва анализа, от него зависят правилните настройки на PCR оборудването и интерпретацията на резултатите. Лекарите в медицински център Euromedprestige имат богат опит в провеждането на ДНК диагностика, което гарантира надеждността на резултатите от изследванията и гарантира положителен успех в лечението инфекциозни заболявания. Да се ​​​​тества по метода PCR и провеждане пълна диагностикаи лечение на инфекциозни заболявания в нашата медицински център"Евромедпрестиж".

По време на откриването на продуктите на амплификация, получената смес от продукти на амплификация се отделя. Към сместа се добавят специални разтвори, които дават способността на ДНК фрагментите да флуоресцират – отразявайки се в оранжево-червени светещи ивици. Полученото сияние показва наличието на ДНК на вируси, микроби или бактерии в материала, взет от пациента за PCR анализ.

GOU VPO "Красноярска държавна медицинска академия"

на името на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие Ясенецки »

Катедра по медицинска генетика и клинична неврофизиология IPO

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Инструментариумза 3-4 годишни ученици

по специалностите обща медицина (060101) и

Красноярск - 2007г

Шнайдер, Н. А., Бутянов, Р. А. Основни принципи на метода на полимеразна верижна реакция. Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курс по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Издателство на Държавната образователна институция за висше професионално образование KrasSMA, 2007. – 42 с.

Методическото ръководство напълно отговаря на изискванията на Държавния стандарт (2000) и отразява основните аспекти модерен методдиагностика наследствени заболяваниячовек – метод на полимеразна верижна реакция, учебен материал, адаптиран към образователни технологиикато се вземат предвид спецификите на обучението в 3-4 години медицински и педиатрични факултети.

Рецензенти:Ръководител на катедрата по медицинска генетика, Държавно учебно заведение за висше професионално образование

„Новосибирски държавен медицински университет към Федералната агенция по здравеопазване и социално развитие“, доктор на медицинските науки, професор;

репликация на ДНК

Обектът на изследване на този метод е дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК). ДНК е универсалният носител на генетична информация във всички организми, съществуващи на Земята (с изключение на РНК-съдържащите микроорганизми). ДНК е двойна верига, усукана в спирала. Всяка верига се състои от нуклеотиди, свързани в последователност. ДНК веригите имат противоположни посоки: 5" края на едната верига съответства на 3" края на втората верига. Уникален имотДНК е нейната способност да се удвоява. Този процес се нарича репликация. Репликацията на ДНК молекулата се извършва по време на синтетичния период на интерфазата. Всяка от двете вериги на „майчината” молекула служи като шаблон за „дъщерната”. След репликация, новосинтезираната ДНК молекула съдържа една верига „майка“, а втората е новосинтезирана „дъщерна“ верига (полуконсервативен метод). За матричен синтезЗа да се образува нова ДНК молекула, старата молекула трябва да се размотае и разтегне. Репликацията започва на няколко места в молекулата на ДНК. Участъкът на ДНК молекула от началната точка на една репликация до началната точка на друга се нарича репликон.

Стартът на репликацията е активиран грундове(праймери), състоящи се от 100-200 нуклеотидни двойки. Ензимът ДНК хеликаза се развива и разделя майчината спирала на ДНК на две вериги, върху които, съгласно принципа на комплементарност, с участието на ензима ДНК полимераза, се сглобяват „дъщерни“ ДНК вериги. За да може ензимът да започне своята работа, е необходимо наличието на стартов блок - малък начален двуверижен фрагмент. Началният блок се формира от взаимодействието на праймера с комплементарния регион на съответната верига на родителската ДНК. Във всеки репликон ДНК полимеразата може да се движи по протежение на „майчината” верига само в една посока (5`=>3`).

На водещата верига, докато репликонът се развива, "дъщерна" верига постепенно нараства непрекъснато. На изоставащата верига дъщерната верига също синтезира в посока (5`=>3`), но на отделни фрагменти, докато репликонът се развива.

По този начин добавянето на комплементарни нуклеотиди на "дъщерните" вериги става в противоположни посоки (антипаралелно). Репликацията във всички репликони се извършва едновременно. Фрагменти и части от "дъщерни" вериги, синтезирани в различни репликони, се зашиват в една верига от ензима лигаза. Репликацията се характеризира с полуконсервативност, антипаралелизъм и прекъсване. Целият геном на една клетка се репликира веднъж за период от време, съответстващ на един митотичен цикъл. В резултат на процеса на репликация от една ДНК молекула се образуват две ДНК молекули, в които едната верига е от майчината ДНК молекула, а втората, дъщерната, е новосинтезирана (фиг. 1).

Ориз. 1. Схема на репликация на ДНК молекула.

По този начин цикълът на репликация на ДНК включва три основни етапа:

1. размотаване на спиралата на ДНК и разминаване на веригите (денатурация);

2. закрепване на грундове;

3. завършване на веригата на дъщерната нишка.

Принцип на PCR метода

Репликацията на ДНК е тази, която формира основата на PCR. При PCR горните процеси се извършват в епруветка в цикличен режим. Преходът от един етап на реакция към друг се постига чрез промяна на температурата на инкубационната смес. Когато разтворът се нагрее до 93-95°C, настъпва денатурация на ДНК. За да се премине към следващия етап - добавяне или "отгряване" на праймери - инкубационната смес се охлажда до 50-65°C. След това сместа се нагрява до 70-72°C - оптималната за taq-ДНК полимераза - на този етап се осъществява изграждането на нова ДНК верига. След това цикълът се повтаря отново. С други думи PCR методът е многократно увеличаване на броя на копията (усилване) специфичен участък от ДНК, катализиран от ензима ДНК полимераза.

Растежът на дъщерните ДНК вериги трябва да се случи едновременно и на двете вериги на майчината ДНК, така че репликацията на втората верига също изисква свой собствен праймер. По този начин към реакционната смес се добавят два праймера: един за веригата "+", вторият за веригата "-". Прикрепени към противоположните вериги на ДНК молекулата, праймерите се ограничават до частта от нея, която впоследствие ще бъде дублирана или амплифицирана многократно. Дължината на такъв фрагмент, наречен ампликон, обикновено е няколко стотин нуклеотида.

Етапи на PCR

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия (фиг. 2).

· Етап 1:денатурация на ДНК . Настъпва при 93-95° за 30-40 секунди.

· Етап 2:грунд отгряване . Прикрепването на праймери се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфичен регион. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване 20-60 сек.

· Етап 3:завършване на ДНК веригите Допълнителното завършване на ДНК веригите става от 5" края до 3" края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на свързване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеозид трифосфати, добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима taq полимераза и протича при температура 70-72°C. Времето за синтез е 20-40 секунди.

Новите ДНК вериги, образувани в първия цикъл на амплификация, служат като шаблони за втория цикъл на амплификация, в който се образува специфичен фрагмент на ДНК ампликон (фиг. 3). В следващите цикли на амплификация ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги.

По този начин натрупването на ампликони в разтвора става съгласно формулата 2", където n е броят на циклите на амплификация. Следователно, дори ако първоначалният разтвор първоначално съдържа само една двойноверижна ДНК молекула, след това в 30-40 цикъла около В разтвора се натрупват 108 ампликонови молекули, което е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел.

Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат ( термоциклер), който по зададена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

За да се извърши усилване, са необходими следните компоненти:

· ДНК матрица(ДНК или част от нея, съдържаща желания специфичен фрагмент);

· Грундове(синтетични олигонуклеотиди (20-30 нуклеотидни двойки), комплементарни на ДНК последователностите в границите на специфичния фрагмент, който се определя). Изборът на специфичен фрагмент и подборът на праймери играе критична роля за специфичността на амплификацията, което влияе върху качеството на анализа.

· Смес от дезоксинуклеотид трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTPs, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги в еквивалентни концентрации от 200-500 µM)

· ЕнзимTaq- полимераза(термостабилна ДНК полимераза, която катализира удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към нарастващата верига от синтезирана ДНК, 2-3 тМ).

· Буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност, pH 6,8-7,8).

За да се идентифицират специфични региони на генома на РНК вируси, първо се получава ДНК копие от РНК шаблон, като се използва реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима ревертаза (обратна транскриптаза).

Ориз. 2. Усилване (1-ви цикъл).

Ориз. 3. Усилване (2-ри цикъл).

Основни приложения на PCR

· клинична медицина:

o диагностика на инфекции,

o идентифициране на мутации, включително диагностика на наследствени заболявания,

o генотипизиране, включително HLA генотипиране,

o клетъчни технологии

· екология (като начин за наблюдение на състоянието и качеството на обектите на околната среда и хранителните продукти)

· определяне на трансгенни организми (ГМО)

Лична идентификация, установяване на бащинство, криминалистика

· обща и специфична биология,

Основни принципи

организиране на диагностични лаборатории

Работата в PCR лабораторията се извършва в съответствие с „Правилата за проектиране, предпазни мерки, промишлена санитария, противоепидемичен режим и лична хигиена при работа в лаборатории (отдели, отдели) на санитарни и епидемиологични институции на системата на здравеопазването.

Замърсяване на ДНК проби

Провеждането на PCR диагностика е свързано с проблем поради високата чувствителност на метода – възможността замърсяване. Влизането на следи от положителна ДНК в реакционната епруветка (специфични продукти за амплификация на ДНК - ампликони; ДНК стандарт, използван като положителна контрола; положителна ДНК от клинична проба) води до амплификация на специфичен ДНК фрагмент по време на PCR и в резултат на това , до появата на фалшиви положителни резултати.

В процеса на работа може да срещнете два вида замърсяване:

1. кръстосано замърсяванеот проба на проба (по време на обработка на клинични проби или при разтваряне на реакционната смес), което води до спорадични фалшиво положителни резултати;

2. замърсяване с продукти за усилване(ампликони) имащи най-висока стойност, защото по време на PCR процеса ампликоните се натрупват в огромни количества и са идеални продукти за реамплификация.

Замърсяването на стъклария, автоматични пипети и лабораторно оборудване, повърхността на лабораторните маси или дори повърхността на кожата на лабораторните работници със следи от ампликони води до систематични фалшиво положителни резултати. Определянето на източника на замърсяване може да бъде много трудно и изисква значителна инвестиция на време и пари. Натрупаният досега опит в лаборатории, използващи метода PCR за диагностика, ни позволява да формулираме основните изисквания за организацията на такива лаборатории и провеждането на самите анализи. Спазването на тези изисквания елиминира възможността от замърсяване и фалшиво положителни резултати.

Етапи на PCR анализ

Те са географски разделени чрез поставянето им в отделни помещения (фиг. 4, 5):

· Предварителна PCR стая,където се обработват клинични проби, изолира се ДНК, приготвя се реакционна смес за PCR и се извършва PCR (при наличие на условия се препоръчва и последните два етапа да се извършват в допълнително отделно помещение). В тези помещения е забранено извършването на всякакви други видове работа с тестови агенти, чиято PCR диагностика се извършва в тази лаборатория.

· Стая за пост-PCR,където се извършва откриване на продукти на амплификация. В тази стая могат да се използват други методи за откриване. Препоръчително е помещението за откриване на продукта на амплификация да се разположи възможно най-далеч от стаите за пред-PCR.

Работните помещения са оборудвани с ултравиолетови лампи с максимална радиация от порядъка на 260 nm (тип DB-60) при разход 2,5 W на 1 m3. Лампите са разположени така, че повърхностите на работните маси, оборудването и материалите, с които операторът има контакт по време на PCR анализ, са изложени на директно облъчване. Облъчването се извършва в рамките на 1 час преди започване на работа и в рамките на 1 час след приключване на работа.

Лаборантите работят в специално лабораторно облекло, което се сменя при преминаване от една стая в друга и в ръкавици за еднократна употреба. Дрехите от различни стаи се обработват отделно. Различни служители работят на различни етапи от PCR анализа.

За работа се използват отделни комплекти дозатори, пластмасови и стъклени съдове, лабораторно оборудване, престилки и ръкавици, предназначени за различни етапи на анализ и непреносими от една стая в друга. Оборудването, материалите и консумативите във всяка стая са надлежно маркирани.

Всички етапи на работа се извършват само с консумативи за еднократна употреба: накрайници за автоматични пипети, епруветки, ръкавици и др. Не забравяйте да смените накрайниците, когато преминавате от проба на проба. Необходимо е да се използват накрайници с филтър - аерозолна бариера, за да се предотврати навлизането на микрокапки от разтвора в пипетата. Използваните туби и накрайници се изхвърлят в специални контейнери или контейнери, съдържащи дезинфекционен разтвор. Клиничните проби се съхраняват отделно от реагентите.

За обработка и почистване на работното място всяка стая е оборудвана с памучно-марлеви тампони (кърпички), пинсети, дезинфектанти и дезактивиращи разтвори.

Лабораторията за PCR диагностика изключва работа, свързана с производството (клониране) и изолирането на рекомбинантни плазмиди, съдържащи ДНК последователности или генни фрагменти на патогени, които се диагностицират в тази лаборатория.

Събиране на клиничен материал

Материалът, който се изследва за PCR, може да бъде изстъргване на епителни клетки, кръв, плазма, серум, плеврална и цереброспинална течност, урина, храчка, слуз и други биологични секрети, биопсии.

Материалът се събира в лечебна зала с подходящ профил. След вземането пробите трябва да бъдат доставени в PCR диагностичната лаборатория възможно най-скоро.

Пробите трябва да се вземат със стерилни, за предпочитане инструменти за еднократна употреба, само в стерилни пластмасови или стъклени епруветки за еднократна употреба, предварително обработени за един час с хромна смес, старателно измити с дестилирана вода и калцинирани в сушилен шкаф при температура 150°C за 1 час.

Зона на детекция (друг етаж или друга сграда).

Ориз. 4. PCR лабораторен апарат с детекция чрез електрофореза.

Зона на детекция (друг етаж или друга сграда)

Ориз. 5. PCR лабораторен апарат с флуоресцентна детекция (количествен анализ).

Ориз. 6. Стая за екстракция на ДНК.Показана е настолна кутия с бактерицидна лампа.

Ориз. 7. Стая за усилване.

Ориз. 8. Стая за откриване.

Ориз. 9. Кръвни проби за ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Съхранение и транспортиране на проби

За диагностициране на наследствени заболявания кръвните проби се съхраняват на специални хартиени форми или в епиндорфи (пластмасови епруветки) в замразено състояние за дълго време (фиг. 9).

За диагностициране на инфекциозни заболявания пробите се държат при стайна температура за не повече от 2 часа. Ако е необходимо по-продължително съхранение, пробите могат да се поставят в хладилник при температура 2-8°C за период не повече от един ден. Допустимо е по-продължително съхранение (до 2 седмици) замразено във фризер при температура минус 20°C. Не се допуска повторно замразяване и размразяване на проби.

Ако диагностичната лаборатория за PCR и процедурната зала за вземане на проби са географски разделени, тогава транспортирането на проби трябва да се извършва в термоси или термоконтейнери в съответствие с правилата за съхранение на проби и правилата за транспортиране на инфекциозни материали.

Екстракция на ДНК от проби

Методът на сорбция в твърда фаза стана широко разпространен, който се състои в добавяне на лизиращ агент, съдържащ разтвор на гуанидин, сорбция на ДНК върху сорбент, многократно промиване и резорбция на ДНК с буферен разтвор. При обработката на серум, плазма или цяла кръв обикновено се използва методът за екстракция с фенол. Методът включва депротеинизация с фенол/хлороформ, последвана от утаяване на ДНК (или РНК) с етанол или изопропанол. Обработката се извършва в микроцентрофужни епруветки Eppendor P с обем 1,5 ml. Времето за обработка е 1,5-2 часа (фиг. 10).

Ориз. 10. Екстракция на ДНК.

Провеждане на PCR

Определено количество проба от обработената клинична проба се прехвърля в специална микроцентрофужна епруветка тип Eppendorf с обем 0,2 или 0,5 ml, към която се добавя смес за амплификация, състояща се от вода, PCR буфер, dNTP разтвор, праймерен разтвор и разтвор. същата епруветка Taq полимераза (добавена към сместа последна). Обикновено обемът на реакционната смес е 25 µl. След това се добавя една капка минерално масло към всяка епруветка, за да се предотврати изпаряването на реакционната смес по време на процеса на амплификация. тръбите се прехвърлят в програмируем термостат (усилвател), където усилването се извършва автоматично по зададена програма (фиг. 11).

Ориз. единадесет. усилвател " Термоциклер ».

Времето за реакция в зависимост от зададената програма е 2-3 часа. Паралелно с експерименталните проби се поставят и контролни проби: положителната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо материала на клиничната проба се добавя контролен ДНК препарат на изследвания ген. Отрицателната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо клиничния материал или ДНК препарат се добавя подходящо количество дейонизирана вода или екстракт, който не съдържа изследваната ДНК. Необходима е отрицателна контрола, за да се проверят реакционните компоненти за отсъствие на ДНК поради замърсяване и за изключване на фалшиво положителни резултати.

Регистрация на резултатите

Амплифицираният специфичен ДНК фрагмент се открива чрез електрофореза в агарозен гел в присъствието на етидиев бромид. Етидиевият бромид образува стабилно интерстициално съединение с ДНК фрагменти, което се появява под формата на светещи ленти, когато гелът се облъчи с UV лъчение с дължина на вълната 290-330 nm. В зависимост от размера на ампликоните, образувани в резултат на PCR, се използва гел със съдържание на агароза от 1,5% до 2,5%. За да се приготви агарозен гел, смес от агароза, буфер и вода се разтопява в микровълнова фурна или на водна баня и се добавя разтвор на етидиев бромид. Охладената до 50-60°С смес се изсипва във формата на слой с дебелина 4-6 мм и със специални гребени в гела се правят джобове за нанасяне на пробата. Гребените се монтират по такъв начин, че между дъното на ямките и основата на гела да остане слой агароза с дебелина 0,5-1 mm. След като гелът се втвърди, усилвателят се нанася върху джобовете в количество от 5-15 μl. Препоръчително е да се извърши електрофореза на смес от маркери за дължина на ДНК фрагменти успоредно с контролни и експериментални проби. Обикновено такава смес съдържа десет ДНК фрагмента с дължина 100, 200, 300 и т.н. базови двойки.

Използването на такъв тест дава възможност да се провери дължината на ампликоните в контролни и експериментални проби. Гелът с нанесената проба се прехвърля в камера за електрофореза, пълна с буфер, камерата се свързва към източник на захранване и се извършва електрофоретично разделяне на продуктите на амплификацията за 30-45 минути при напрегнатост на електрическото поле 10-15 V/ см. В този случай предната част на багрилото, включено в реакционната смес, трябва да измине най-малко 3 cm.

След като електрофорезата приключи, гелът се прехвърля в стъклен трансилюминатор и се гледа под ултравиолетова светлина. За документиране гелът се снима на филм Micrat 300 или се записва с помощта на видео система, свързана с компютър.

На първо място се оценяват контролни проби. Трябва да има оранжева светеща лента в електрофоретичната следа, съответстваща на положителната контрола. Неговата електрофоретична подвижност трябва да съответства на дължината на ампликона, посочена в инструкциите.

В електрофоретичната следа, съответстваща на отрицателната контрола, такава лента трябва да отсъства. Наличието на такава лента в отрицателната контрола показва замърсяване - замърсяване на реагентите, използвани с тест ДНК или ампликон. Тестовите проби се оценяват по наличието на лента в съответната писта, която е разположена на същото ниво като лентата в положителната контролна проба. Интензитетът на лентата съответства на количеството ДНК, което се тества в пробата, което позволява полуколичествена оценка на PCR. Обикновено положителните резултати се оценяват по четиристепенна скала. Ако светенето на лентата в тестовата проба е много слабо, тогава такава проба трябва да бъде пренаредена (фиг. 12).

Ориз. 12. Електрофореза в агарозен гел.

Приложения на PCR задиагностика на точкови мутации и генни полиморфизми

Една от водещите области на приложение на PCR в практическото здравеопазване е диагностиката на точкови мутации и генни полиморфизми . Има директни и косвени методи за ДНК диагностика. В ситуации, когато е известен ген, увреждането на което води до развитие на наследствено заболяване, това увреждане може да бъде открито чрез молекулярно-генетични методи. Такива методи се наричат ​​директни. Чрез директни методи се откриват нередности в първичната нуклеотидна последователност на ДНК (мутации и техните видове). Директните методи се характеризират с точност, достигаща почти 100%.

На практика обаче тези методи могат да се използват при определени условия:

· с известна цитогенетична локализация на гена, отговорен за развитието на наследствено заболяване;

· генът на заболяването трябва да бъде клониран и неговата нуклеотидна последователност да е известна.

Целта на директната ДНК диагностика е да се идентифицират мутантни алели.

По този начин, в ситуации, когато е известно какъв вид увреждане на ДНК води до наследствено заболяване, ДНК фрагментът, съдържащ увреждането, се изследва директно, т.е. използва се методът за директна ДНК диагностика.

Към днешна дата обаче гените на много заболявания не са картографирани, тяхната екзон-интронна организация е неизвестна и много наследствени заболяваниясе характеризират с изразена генетична хетерогенност, която не позволява пълното използване на директни методи за ДНК диагностика. Ето защо в случаите, когато локализацията на увреждането е неизвестна, се използва друг подход, свързан с изследване на близостта на гена, отговорен за генното заболяване, в комбинация с фамилен анализ, т.е. индиректни методи за молекулярно-генетична диагностика на се използват наследствени заболявания.

Може да се използва за откриване на точкови мутации и малки делеции различни начини, но всички те се основават на използването на метода PCR. Тази реакция ви позволява да умножите многократно нуклеотидната последователност на ДНК и след това да търсите мутации. Методите за търсене на ДНК фрагменти, носещи мутации, се основават на сравнителен анализмутантни и нормални ДНК нуклеотидни последователности.

Анализ на PCR продукти

в процеса на директна ДНК диагностика

Включва изследване на специфични характеристики на амплифицираната генна област. По този начин, при заболявания, причинени от експанзия на тринуклеотидни повторения, продуктите на амплификация се различават по дължината си (отразяваща различния брой триплети в изследваната генна област) и, като следствие, по скоростта им на движение в гела. Благодарение на това се постига ясно електрофоретично разделяне на нормални и мутантни алели и точно определяне на патологично удължен фрагмент, т.е. ДНК диагностика на заболяването (фиг. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ориз. 14. Диагностика на изтриване GAG в ген DYT 1 при пациенти с допа-независима дистония (електрофореза с полиакриламиден гел). Пътища 2,3,6 – болни; писти 1,4,5 – управление. Тънката стрелка показва нормалния алел, дебелата стрелка показва мутантния по-къс алел (делеция на три нуклеотида).

Ако цялата изследвана ДНК област е част от разширена делеция, тогава PCR амплификацията на ДНК от този изтрит алел няма да бъде извършена поради липсата на места за праймерна хибридизация. В този случай хомозиготна делеция ще бъде диагностицирана въз основа на пълното отсъствие на продукт от PCR реакция (синтезът на ДНК е невъзможен и от двете копия на гена). С хетерозиготна делеция е възможно да се открие PCR продукт, синтезиран от нормален (задържан) алел; обаче, за да се диагностицира надеждно такава мутация, е необходимо да се използват по-сложни методи за изобразяване на ДНК, които позволяват да се оцени дозата на крайната PCR продукт.

За идентифициране на точкови мутации (най-често нуклеотидни замествания) в определени места се използва PCR методът в комбинация с други методи за молекулярно-генетичен анализ. Ако местоположението и природата на предполагаемата точкова мутация са точно известни, тогава рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими) са специални клетъчни ензими, изолирани от различни щамове бактерии.

Тези ензими разпознават специфични нуклеотидни последователности с дължина от четири до десет нуклеотида. След това се извършва рестрикция (лат. (разрязване)) на тези последователности като част от двуверижна ДНК молекула.Всеки рестриктазен ензим разпознава и отрязва на фиксирано място строго определена, специфична нуклеотидна последователност - рестрикционно място (место за разпознаване).

В случаите, когато точкова мутация променя естественото място на разпознаване за определен рестрикционен ензим, този ензим няма да може да разцепи мутантния PCR-амплифициран фрагмент. В някои случаи мутацията води до появата на ново място за разпознаване за конкретен рестрикционен ензим, който обикновено отсъства.

И в двете ситуации мутантните и нормалните PCR продукти, третирани с избрания рестрикционен ензим, ще произведат рестрикционни фрагменти с различни дължини, които могат лесно да бъдат открити чрез електрофореза (фиг. 15).

По този начин, ако е необходимо бързо да се открие някаква специфична точкова мутация, задачата се свежда до търсене на съответния рестрикционен ензим, чието място за разпознаване е локализирано на мястото на нарушената нуклеотидна последователност. Третирането на PCR продукти с такъв рестрикционен ензим ще направи възможно лесното разграничаване на нормалните и мутантните алели. Рестрикционният анализ значително опростява откриването на известни точкови мутации и сега се използва широко за директна ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Крайният етап молекулярно-генетичен анализ на мутациие да се определи нуклеотидната последователност на изследвания ДНК фрагмент (секвениране), която се сравнява с нормата и се формулира окончателна генетична диагноза. Благодарение на успехите на молекулярната генетика сега са разработени методи за ДНК диагностика на повече от 400 наследствени заболявания.

Ориз. 15. Откриване на точкова мутация чрез рестрикционен анализ: A – амплифицирана генна област, съдържаща рестрикционно мястоAGCTза рестрикционна ендонуклеазаАлу аз. МутацияЖ→ Апроменя тази нуклеотидна последователност, което води до рестрикционен ензимАлуИблокиран; B – електроферограма на рестрикционни продукти: писта 1 – хомозиготност за нормалния алел; писта 2 – хомозиготност за мутация; път 3 – хетерозиготно състояние (нормален алел + мутация).

Диагностиката на наследствени заболявания, основана на директно изследване на мутантни алели при пациенти, членове на техните семейства или съмнения за хетерозиготни носители на патологични мутации, е подходяща за пресимптоматична и пренатална диагностика, която може да се прилага в най-ранните етапи от развитието на плода, преди поява на някакви клинични или биохимични симптоми на заболяване.

Независимо от метода за откриване на мутации, точните молекулярни характеристики на всяка мутация могат да бъдат получени само чрез директно секвениране. За автоматизиране на този процес през последните години широко се използват специални устройства - секвенатори, които позволяват значително да се ускори процесът на четене на ДНК информация.

Пътят към по-широко използване на молекулярно-биологични изследвания в клинични диагностични лаборатории се отваря чрез ускоряване на аналитичния процес чрез извършване на всички процедури в един континуум, без трансфер на проба, създаване на условия за предотвратяване на замърсяване по време на паралелно тестване на редица аналити и чрез обективно записване на резултати във всеки цикъл.

Основни модификации на PCR метода

Използва се за бързо сканиране и търсене на известни генни мутации.

Мултиплексна (мултипраймерна) PCR

Този метод се основава на едновременната амплификация на няколко екзона на изследвания ген в една реакция. Това позволява рентабилен бърз скрининг на най-честите мутации. Например, за бързо диагностициране на носителството на делеции в гена за дистрофин при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, се извършва едновременна амплификация на набор от най-често мутиралите екзони на този ген. Тъй като тези заболявания се унаследяват по Х-свързан рецесивен начин и са свързани с увреждане на единствената Х хромозома при момчетата, в случай на разширена делеция, електрофорезата на реакционните продукти ще разкрие липсата на един или повече ДНК фрагменти (екзони). ), което може да служи като молекулярно потвърждение на диагнозата. В допълнение, чрез избиране на специфични генни секции за PCR амплификация е възможна сравнително точна оценка на общата дължина на делецията и точките на прекъсване на гена (до екзона).

Комбинираното използване на няколко мултиплексни реакции прави възможно диагностицирането на до 98% от всички делеции, възникващи при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер. Това представлява приблизително 60% от общия брой известни мутации в гена за дистрофин и показва много високата ефективност на този метод за скрининг за ДНК диагностика на дистрофинопатии (фиг. 16).

Ориз. 16. Директна ДНК диагностика на мускулна дистрофия на Дюшен чрез мултиплексна PCR (електрофореза в агарозен гел). Във всеки от изследваните индивиди четири екзона на дистрофиновия ген са амплифицирани едновременно (екзони 17, 19, 44 и 45; стрелките показват съответните продукти на амплификация). Ивица 1 – контрола, ленти 2-5 – пациенти с мускулна дистрофия на Дюшен с различни делеции на гена за дистрофин (ленти 2 и 5 – делеция на екзон 45, пътека 3 – делеция на екзон 44, пътека 4 – делеция на екзони 17 и 19 ).

Алел-специфична амплификация

Методът се основава на използването на две независими двойки праймери за специфичен генен регион: един праймер и в двете двойки е общ, а вторият праймер във всяка двойка има различна структура и е комплементарна към нормална или мутантна ДНК последователност. В резултат на такава реакция в разтвор могат да се синтезират едновременно два вида PCR продукти - нормални и мутантни. Освен това дизайнът на използваните праймери прави възможно ясното разграничаване на нормалните и мутантните продукти на амплификация по техния молекулен размер. Този метод е много визуален и ви позволява да проверите както хомо-, така и хетерозиготно носителство на мутантния алел.

Метод за сайт-насочена модификация на амплифицирана ДНК

Методът се основава на използването на т. нар. mismatch праймер в PCR (не напълно комплементарен на шаблона), който се различава от шаблонната ДНК последователност с един нуклеотид. В резултат на включването на посочения праймер в мутантния PCR продукт, в него се образува изкуствено създадено рестрикционно място за една от рестрикционните ендонуклеази, което позволява директна ДНК диагностика на определена известна мутация чрез рестрикционен анализ. Създаването на такова изкуствено рестрикционно място е необходимо, ако търсенето не разкри съществуването на известен и достъпен ензим, чието „естествено“ рестрикционно място е засегнато в резултат на появата на изследваната мутация в ДНК молекулата .

PCR метод с обратна транскриптаза (RT- PCR)

Този метод се използва в случаите, когато е по-удобно да се използва не геномна ДНК като обект на изследване, а по-компактна и богата на информация сДНК, получена след подходяща обработка на тъканни проби, например биопсичен материал или клетъчни линии от лимфоцити, фибробласти и др. Важно условие тук е експресията (поне минимална) на желания ген в изследваната тъкан.

На първия етап се извършва обратна транскрипция на иРНК и получените cDNA молекули служат като шаблон за PCR. Впоследствие, критичната област на сДНК, амплифицирана в достатъчно количество, се подлага на секвениране и други методи за мутационен скрининг, директно електрофоретично изследване (откриване на делеции, инсерции и т.н.) или интегриране в експресионна система, за да се получи протеинов продукт и нейния директен анализ.

Този метод е особено ефективен за откриване на мутации, водещи до синтеза на "пресечен" протеин (безсмислени мутации, сплайсинг мутации, големи делеции) - така нареченият PTT анализ (Protein Truncation Test). PTT анализът обикновено се използва при изследване на дълги гени с множество екзони, като мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, атаксия-телеангиектазия или неврофиброматоза тип 1.

PCR в реално време(PCR в реално време, английски)

Всяка година PCR в реално време става все по-популярен диагностичен метод в практическото здравеопазване. Основната му характеристика е мониторингът и количественият анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматичното регистриране и интерпретация на получените резултати. Този метод не изисква етап на електрофореза, което намалява изискванията за PCR лаборатория. Благодарение на спестяването на производствено пространство, намаляването на броя на персонала и търсенето на количествено определяне на ДНК/РНК, този метод се използва успешно през последните години в най-големите санитарно-епидемиологични, диагностични и изследователски центрове в развитите страни по света, заменяйки PCR в сегашния („класически“) формат.

PCR в реално време използва флуоресцентно белязани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК, докато се усилва. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и теоретично може да открие дори една ДНК или РНК молекула в проба.

Ориз. 17. PCR в реално време.

PCR в реално време използва система TaqMan, която контролира кинетиката на PCR директно по време на амплификация, използвайки резонансно флуоресцентно потушаване. За откриване се използва сонда, която носи флуорофор и гасител, допълващи средната част на амплифицирания фрагмент. Когато флуорофорът и гасителят са свързани с олигонуклеотидната проба, се наблюдава само малка флуоресцентна емисия. По време на процеса на амплификация, поради 5" екзонуклеазната активност на Taq полимеразата, флуоресцентният етикет преминава в разтвор, освободен от близостта си до гасителя, и генерира флуоресцентен сигнал, който се увеличава в реално време пропорционално на натрупването на усилвателя ( Фиг. 17).

Основните предимства на PCR в реално време пред PCR с гел електрофореза:

· Целият метод се извършва в една епруветка;

· Методът отнема 1 час;

· Достатъчни са 1-2 работни стаи;

· Наред с качествената оценка на резултата има възможност за количествена оценка (например при предписване на антивирусна терапия за СПИН или вирусен хепатит е необходимо да се знае вирусният товар, т.е. количеството вирус на единица, което се предоставя чрез PCR в реално време);

· Рискът от замърсяване е рязко намален.

Заключение

PCR методът е един от най-разпространените методи за молекулярно-биологични изследвания. Този метод трябва да се използва интелигентно от клиницистите и лекарят, който реши да използва PCR в работата си, трябва да има определени познания за характеристиките и възможностите на този метод. Второ, трябва да има тясна обратна връзка между клинициста и PCR лабораторията, която е необходима за анализиране на сложни случаи и разработване на правилната диагностична стратегия. Трето, PCR анализът не е панацея в диагностиката (предимно инфекциозни заболявания) и не замества съществуващите методи на изследване, а само ги допълва. И най-важното е, че PCR не може да замени интуицията и аналитичното мислене, които трябва да притежава лекарят, който очаква успех.

П . С . Молекулярно-биологични изследвания - променящи се насоки за диагностика и лечение. Използването на молекулярно-биологични методи е свързано с перспективата за радикална промяна на акцентите в лабораторната диагностика. Може да не става въпрос само за навременна информация, а за получаването й предварително. Ако сега лабораторните тестове в повечето случаи се извършват вече, когато заболяването се е развило и лечението е започнало, тогава се очаква информацията от молекулярно-биологичната лаборатория да позволи да се идентифицира склонността на дадено лице към определени видове патология и степента на чувствителност към определени лекарства. , което ще оправдае предсказващия, превантивен и персонализиран характер на бъдещата медицина.

ПРОМЯНА НА ДИАГНОЗАТА И ОРИЕНТАЦИИТЕ НА ЛЕЧЕНИЕТО

НАСЛЕДСТВЕНИ БОЛЕСТИ

Днес В бъдещето

Диагноза Генетичен паспорт

8. Колко работни помещения са необходими за работа на PCR лаборатория с флуоресцентно откриване (количествен анализ, PCR в реално време)?

9. Какво е откриване?

10. Какви методи за ДНК диагностика има?

11. Работата на кой ензим е в основата на PCR?

12. Защо зоната на детекция трябва да бъде премахната от другите работни зони?

13. Какво е сайт за ограничаване?

14. Какви са разликите между директните и индиректните методи за ДНК диагностика?

15. Какво е секвениране?

16. Какво е мултиплексна PCR?

17. Какви видове мутации се определят чрез PCR?

18. Какво е замърсяване?

19. Каква е същността на метода за алел-специфична амплификация?

20. Условия за съхранение на PCR материал?

21. В какво устройство се извършва усилване?

22. Какво представлява методът PCR с обратна транскриптаза (RT-PCR)?

23. Какво служи като материал за PCR диагностика?

24. Избройте видовете замърсяване?

Тестове за самоподготовка

1. Ендонуклеазни рестрикционни ензими:

а) ензими, които "разбиват" ДНК на строго определени места;

б) ензими, които съединяват разкъсванията в молекулата на ДНК;

в) ензими, които осигуряват съединения, които извършват възстановяване на ДНК.

2. Генна амплификация:

3. Кой метод на молекулярна генетика се използва за диагностициране на заболявания, причинени от мутантен ген с известна последователност?

а) използване на специфичен рестрикционен ензим;

б) директно откриване с помощта на специфични молекулярни проби;

V) семеен анализразпределения на нормални полиморфизми на дължина на рестрикционни фрагменти.

4. ДНК секвениране:

а) идентифициране на базовата последователност на ДНК;

б) многократни повторения на всяка ДНК секция;

в) изолиране на ДНК фрагмент, съдържащ изследвания ген.

5. За получаване на ДНК проби можете да използвате :

б) хорионни въси;

в) амниотична течност;

г) клетки от амниотична течност;

д) биопсични проби от кожа, мускули, черен дроб,

д) всичко е правилно с изключение на точка "в",

g) всичко е правилно с изключение на точка „d“,

з) всичко по-горе е вярно.

6. За да се диагностицира кои мутации се използва PCR методът:

а) геномни;

б) хромозомни;

в) ген (точка).

7. Грундът е:

а) комплементарна секция на ДНК;

b) белязана (радиоактивно или флуоресцентно) последователност със синтетичен олигонуклеотид, комплементарна на мутантен или нормален ген;

в) олигонуклеотид, който действа като "праймер" и инициира синтеза на полинуклеотидна верига върху ДНК или РНК матрица.

8. Кой е разработил принципа на PCR метода?

б) К. Мълис

9. Методът PCR използва ли се за диагностициране на експанзия на тринуклеотидни повторения (динамичен тип мутация)?

10. В какви области се използва PCR?

а) клинична медицина;

б) определяне на трансгенни организми (ГМО)

в) лична идентификация, установяване на бащинство, криминалистика

г) всичко по-горе,

д) нито едно от горните..

Примерни отговори: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – д; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – ж.

Основен

1.Бочков генетика. Москва. ГЕОТАР, 2002.

Допълнителен

1. , Бахарев и лечение на вродени и наследствени заболявания при деца. – Москва, 2004 г.

2. ДНК диагностика и медико-генетично консултиране. – Москва, 2004 г.

3. Генетика на Гинтер. – Москва, 2003 г.

4. Горбунов основи на медицинската генетика. – Санкт Петербург: Интермедика, 1999.

5. Дж. Макгий. Молекулярна клинична диагноза. – Свят, 1999г.

6. Меншиков - биологични изследвания в клиничната лабораторна диагностика: възможности на проблема (лекции). Клинична лабораторна диагностика, № 3, 2006 г.

7. Работата на Корниенко в PCR лабораторията по време на вградения анализ на биологичен материал. Клинична лабораторна диагностика, бр.10, 2006г.

8. Организация на работата на PCR лабораторията. Методически указания. MU 1.3.1794-03. Главен санитарен лекар на Руската федерация, 2003 г.

9. Ерлих Х. А. PCR технология. – Пърчин-Елмър Сетус, 1993 г.

10. Heid C. A., Stevens J. Количествен PCR в реално време. Genome Res. – бр.6, 1996г.

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курс по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103).

GOU VPO "Красноярска държавна медицинска академия на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие"

Русия, Красноярск,

Федерална агенция за образование

състояние образователна институция

По-висок професионално образование

"Карелска държавна педагогическа академия"

Курсова работа по темата:

Полимеразна верижна реакция (PCR) и нейното приложение

Изпълнено от: студент Корягина Валерия Александровна

Проверено от: Карпикова Наталия Михайловна

Петрозаводск 2013 г

Въведение

Глава 1. Литературен преглед

1.5.4 Ефект на платото

1.5.6 Усилване

Заключение

Въведение

Последните двадесет години бяха белязани от широкото въвеждане на молекулярно-генетичните методи в биологичните, медицинските и селскостопанските науки.

До началото на 70-те години изглеждаше, че молекулярната биология е достигнала известна степен на зрялост. През този период основният обект на молекулярно-генетичните изследвания са микроорганизмите. Преходът към еукариоти поставя изследователите пред напълно нови проблеми, които не могат да бъдат решени с помощта на методите за генетичен анализ, съществуващи по това време. Пробивът в развитието на молекулярната генетика стана възможен благодарение на появата на нов експериментален инструмент - рестрикционни ендонуклеази. През следващите години броят на методите за директен ДНК анализ, базирани на качествено различни подходи, започва бързо да нараства.

Съвременните технологии в много случаи са направили възможно да започне изучаването на фината структурна и функционална организация на ядрените и извънядрените геноми на различни организми на по-дълбоко ниво. Това беше от особено значение за разработването на нови диагностични и лечебни методи различни заболявания. Не по-малко важна беше възможността за използване на постиженията на молекулярната генетика в популационната биология и развъждането за идентифициране и анализ на генетичната променливост на популации, сортове и щамове, идентифициране и сертифициране на икономически ценни индивиди, създаване на генетично модифицирани организми и за решаване на други проблеми.

Всеки метод има своите предимства и недостатъци. Няма универсален метод, който да разреши всички възникнали проблеми. Следователно изборът на конкретен метод за провежданото изследване е един от най-важните етапи на всяка научна работа.

Глава 1. Литературен преглед

1.1 История на откриването на полимеразната верижна реакция (PCR)

През 1983 г. К.Б. Мълис и др. публикуват и патентоват метода на полимеразна верижна реакция (PCR), който е предопределен да има дълбоко въздействие върху всички области на изследване и приложение на нуклеинови киселини. Стойността на този метод за молекулярна биологияи генетиката се оказа толкова голяма и очевидна, че след седем години авторът беше награден Нобелова наградапо химия.

В началото на използването на метода, след всеки цикъл на нагряване-охлаждане, беше необходимо да се добави ДНК полимераза към реакционната смес, тъй като тя беше инактивирана при висока температура, необходима за разделяне на нишките на спиралата на ДНК. Реакционната процедура беше относително неефективна и изискваше много време и ензими. През 1986 г. методът на полимеразна верижна реакция е значително подобрен. Предложено е да се използват ДНК полимерази от термофилни бактерии. Тези ензими се оказаха термостабилни и успяха да издържат на много реакционни цикли. Използването им направи възможно опростяването и автоматизирането на PCR. Една от първите термостабилни ДНК полимерази е изолирана от бактерии Thermus aquaticusи именуван Taq- полимераза.

Способността да се амплифицира всеки ДНК сегмент, чиято нуклеотидна последователност е известна, и да се получи в хомогенна форма и препаративно количество след завършване на PCR, прави PCR алтернативен метод за молекулярно клониране на къси ДНК фрагменти. В този случай не е необходимо да се използват сложни методически техники, които се използват в генното инженерствос конвенционално клониране. Развитието на PCR метода значително разшири методологичните възможности на молекулярната генетика, и по-специално на генното инженерство, дотолкова, че коренно промени и засили научния потенциал на много от нейните области.

1.2 Видове полимеразна верижна реакция (PCR)

· Вложен PCR- използва се за намаляване на броя на страничните продукти от реакцията. Използват се две двойки праймери и се провеждат две последователни реакции. Втората двойка праймери амплифицира област от ДНК в продукта от първата реакция.

· Обърнат PCR- използва се, когато е известен само малък регион в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато става въпрос за определяне на съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома. За извършване на инвертирана PCR се извършват серия от разрези на ДНК с помощта на рестрикционни ензими<#"justify">праймер за полимеразна верижна реакция

· Групово-специфична PCR- PCR за роднини<#"center">1.3 Полимеразна верижна реакция

Открита в средата на 80-те години на миналия век, полимеразната верижна реакция (PCR) може да умножи броя на копията на оригинална проба милиони пъти в рамките на няколко часа. По време на всеки реакционен цикъл се образуват две копия от оригиналната молекула. Всяко от синтезираните копия на ДНК може да служи като шаблон за синтеза на нови копия на ДНК в следващия цикъл. По този начин многократното повторение на циклите води до увеличаване на броя на копията геометрична прогресия. От изчисленията следва, че дори при 30 цикъла, броят на копията на оригиналната молекула ще бъде повече от 1 милиард. Дори ако вземем предвид, че не всички ампликони се дублират по време на всеки цикъл, общият брой копия въпреки това е доста голяма цифра.

Всеки цикъл на полимеразна верижна реакция (PCR) се състои от следните стъпки:

· Денатурация - Повишаването на температурата кара двуверижната молекула на ДНК да се развие и да се раздели на две едноверижни;

· Отгряване - Намаляването на температурата позволява на праймерите да се свържат с комплементарни региони на ДНК молекулата;

· Удължаване - Ензимът ДНК полимераза завършва комплементарната верига.

За амплифициране на избран фрагмент се използват два олигонуклеотидни праймера (праймера), фланкиращи специфична ДНК област. Ориентирани към грундове 3 - завършват един към друг и към последователността, която трябва да се усили. ДНК полимеразата осъществява синтеза (завършването) на взаимно допълващи се ДНК вериги, започвайки с праймери. По време на синтеза на ДНК праймерите са физически интегрирани във веригата от новосинтезирани ДНК молекули. Всяка верига от ДНК молекула, образувана с помощта на един от праймерите, може да служи като шаблон за синтеза на комплементарна ДНК верига, използвайки друг праймер.

1.4 Провеждане на полимеразна верижна реакция (PCR)

Полимеразната верижна реакция се извършва в специални тънкостенни полипропиленови тръби, съвместими по размер с използвания термоциклер (усилвател) - устройство, което контролира температурните и времевите характеристики на етапите на полимеразната верижна реакция (PCR).

1.5 Принцип на метода на полимеразна верижна реакция

Полимеразна верижна реакция (PCR) е in vitro метод за усилване на ДНК, който може да се използва за изолиране и умножаване на специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността да се получи огромен брой копия на един строго определена областгеном значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За провеждане на полимеразна верижна реакция трябва да бъдат изпълнени редица условия:

1.5.1 Наличието на редица компоненти в реакционната смес

Основните компоненти на реакционната (PCR) смес са: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, смес от нуклеотидни трифосфати (ATP, GTP, CTP, TTP), праймери (олигонуклеотиди), ДНК препарат, термостабилна ДНК полимераза. Всеки от компонентите на реакционната смес участва пряко в полимеразната верижна реакция (PCR), а концентрацията на реагентите пряко влияе върху хода на амплификацията.

· Tris-HCl - определя pH на реакционната смес, създава буферен капацитет. Активността на ДНК полимеразата зависи от pH на околната среда, така че стойността на pH пряко влияе върху хода на полимеразната верижна реакция. Обикновено стойността на pH е между 8 и 9,5. Високата стойност на рН се взема, защото рН на Tril-HCl буфера пада с повишаване на температурата.

· KCl - концентрация на калиев хлорид до 50 mM влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване; концентрации над 50 mM инхибират ДНК полимеразата.

· MgCl 2- тъй като ДНК полимеразата е Mg 2+- зависим ензим, тогава концентрацията на магнезиеви йони влияе върху активността на ензима (Mg 2+образува комплекси с NTP - тези комплекси са субстрат за полимеразата). Високата концентрация води до увеличаване на неспецифичното усилване, а ниската концентрация води до инхибиране на реакцията; оптималната (за различни полимерази) е в диапазона от 0,5 - 5 mM. В допълнение, концентрацията на магнезиеви соли влияе върху хода на процесите на денатурация и отгряване - повишаване на концентрацията на Mg 2+причинява повишаване на температурата на топене на ДНК (т.е. температурата, при която 50% от двойноверижните ДНК вериги се разделят на едноверижни).

· NTP - нуклеотидните трифосфати са директни мономери на нуклеиновите киселини. За да се предотврати прекъсването на веригата, се препоръчва еднакво съотношение на четирите нуклеотидни трифосфата. Ниската концентрация на тези компоненти в реакционната смес увеличава вероятността от грешки при конструирането на комплементарна ДНК верига.

· Грундове - Най-оптимално е да се използват грундове с температурна разлика на топене не повече от 2 - 4 о C. Понякога при продължително съхранение при температура 4 о C, или след голям брой замразяване и размразяване, праймерите образуват вторични структури - димери, намаляващи ефективността на PCR. Отстраняването на този проблем се свежда до инкубиране на водна баня (T=95 о В) за 3 минути и последващо бързо охлаждане до 0o СЪС.

· ДНК препарати - количеството и качеството на ДНК препарата (матрицата) пряко влияе върху хода и параметрите на полимеразната верижна реакция. Прекомерните количества ДНК проба инхибират полимеразната верижна реакция (PCR). Примеси различни веществасъдържащите се в ДНК препарата също могат да намалят ефективността на полимеразната верижна реакция (PCR): натриев ацетат, натриев хлорид, изопропанол, етанол, хепарин, фенол, урея, хемоглобин и др.

· ДНК полимераза - при използване на малко количество ДНК полимераза се наблюдава намаляване на синтеза на крайния продукт правопропорционално на размера на фрагментите. Излишъкът от полимераза 2-4 пъти води до появата на дифузни спектри и 4-16 пъти - нискомолекулни неспецифични спектри. Диапазонът на използваните концентрации е 0,5 - 1,5 единици активност на 25 μl PCR смес.

В допълнение към основните компоненти на PCR сместа се използват редица допълнителни вещества, които подобряват качествените и количествените показатели на PCR: ацетамид (5%) - повишава разтворимостта на основните компоненти; бетаин ( натриева сол) - стабилизиране на ДНК полимеразата, понижаване на температурата на топене на ДНК, изравняване на температурата на топене; говежди албумин (10-100 μg/ml) - стабилизиране на ДНК полимераза; диметилсулфоксид (1-10%) - повишаване на разтворимостта на основните компоненти; формамид (2-10%) - повишаване на специфичността на отгряване; глицерол (15-20%) - повишаване на термичната стабилност на ензима, понижаване на температурата на денатурация на ДНК пробата; амониев сулфат - понижаване на температурата на денатурация и отгряване.

1.5.2 Цикличен и температурен режим

Общият вид на програмата за полимеразна верижна реакция (PCR) е както следва:

сцена. Дълготрайна първична денатурация на ДНК препарата 1-ви цикъл

сцена. Бърза денатурация на ДНК препарат. Отгряване на грундове. Удължение.30 - 45 цикъла.

сцена. Дълго удължение. Охлаждане на реакционната смес 1-ви цикъл.

Всеки елемент от етапа - денатурация, отгряване, удължаване - има индивидуални температурни и времеви характеристики. Температурните и времеви параметри за всеки елемент се избират емпирично, в съответствие с качествените и количествени показатели на продуктите на амплификация.

Денатурация. По време на този елемент от полимеразната верижна реакция двуверижната ДНК молекула се разделя на две едноверижни. Температурните параметри на денатурация са в диапазона 90 - 95 о С, но в случай на ДНК проба с високо съдържание на гуанин и цитозин, температурата трябва да се повиши до 98 о C. Температурата на денатуриране трябва да е достатъчна, за да денатурира напълно ДНК веригите и да избегне „бързо охлаждане“ или бързо отгряване, но термостабилната ДНК полимераза е по-малко стабилна при високи температури. По този начин изборът на оптимални температурни параметри на денатурация за съотношението праймер/проба (препарат на ДНК) е важно условие при извършване на амплификация. Ако температурата на денатурация на първия етап е над 95 о C, се препоръчва да се добави ДНК полимераза към реакционната смес след първоначалното денатуриране. Продължителността на този елемент от етапа по време на полимеразната верижна реакция (PCR) трябва да бъде достатъчна, за да денатурира напълно ДНК, но в същото време да няма значителен ефект върху активността на ДНК полимеразата при дадена температура.

Отгряване. Температура на отгряване (Т А ) е един от най-важните параметри на полимеразната верижна реакция. Температурата на отгряване за всеки конкретен грунд се избира индивидуално. Зависи от дължината и нуклеотидния състав на праймера. Обикновено е по-ниска с 2 - 4 о От стойността на точката на топене (Т м ) грунд. Ако температурата на отгряване на системата е по-ниска от оптималната, тогава броят на неспецифичните амплифицирани фрагменти се увеличава и, обратно, повече топлинанамалява количеството на амплифицираните продукти. В този случай концентрацията на специфични ампликони може рязко да намалее, до инхибиране на полимеразната верижна реакция (PCR). Увеличаването на времето за отгряване също води до увеличаване на броя на неспецифичните ампликони.

Удължение. Обикновено всеки тип термостабилна ДНК полимераза има индивидуален температурен оптимум за активност. Скоростта на синтез на комплементарната ДНК верига от ензима също е специфична за всяка полимераза (средно е 30 - 60 нуклеотида в секунда или 1 - 2 хиляди бази в минута), следователно времето за удължаване се избира в зависимост от вида на ДНК полимеразата и дължината на амплифицираната област.

1.5.3 Основни принципи за избор на грундове

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

Грундовете трябва да са специфични. Специално вниманиеплащам 3 - краища на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава е вероятно в епруветката с реакционната смес да се появят нежелани процеси, а именно синтез на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ивици. Това пречи на оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен продукт на амплификация със синтезирана чужда ДНК. Някои праймери и dNTPs се изразходват за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на чувствителност.

Грундовете не трябва да образуват димери и бримки, т.е. стабилни двойни вериги не трябва да се образуват в резултат на праймери, отгрявани сами по себе си или един с друг.

1.5.4 Ефект на платото

Трябва да се отбележи, че процесът на натрупване на специфични продукти на усилване в геометрична прогресия продължава само за ограничено време, след което неговата ефективност спада критично. Това се дължи на така наречения ефект на платото.

Срочен ефект плато използвани за описване на процеса на натрупване на PCR продукти в последните цикли на амплификация.

В зависимост от условията и броя на циклите на реакцията на усилване, в момента на постигане на ефекта плато се влияят от използването на субстрати (dNTPs и праймери), стабилността на реагентите (dNTPs и ензим), количеството на инхибиторите, включително пирофосфати и ДНК дуплекси, конкуренцията за реагенти от неспецифични продукти или праймери на праймера, концентрацията на специфичен продукт и непълна денатурация при високи концентрации на продукти на амплификация.

Колкото по-ниска е първоначалната концентрация на целевата ДНК, толкова по-голям е рискът реакцията да се провали. плато." Тази точка може да възникне преди да има достатъчно специфични продукти за усилване, които да бъдат анализирани. Само добре оптимизирани тестови системи могат да избегнат това.

1.5.5 Приготвяне на биологична проба

За изолиране на ДНК се използват различни техники в зависимост от поставените задачи. Тяхната същност се състои в екстракция (извличане) на ДНК от биологичен препарат и отстраняване или неутрализиране на чужди примеси за получаване на ДНК препарат с чистота, подходяща за PCR.

Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от Мармур, се счита за стандартен и вече е станал класически. Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и повторно утаяване на ДНК с алкохол. Този метод ви позволява да получите чист ДНК препарат. Това обаче е доста трудоемко и включва работа с такива агресивни и силно миришещи вещества като фенол и хлороформ.

Един от популярните в момента методи е методът за екстракция на ДНК, предложен от Boom et al. Този метод се основава на използването на силен хаотропен агент, гуанидин тиоцианат (GuSCN), за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено мляко и др.). След промиване ДНК остава в пробата, сорбирана върху носителя, от който лесно се отстранява с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проба за амплификация. Възможна е обаче загуба на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в проба. В допълнение, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR. Ето защо, когато използвате този метод, е много важно правилен изборсорбент и внимателно спазване на технологичните нюанси.

Друга група методи за подготовка на пробите се основава на използването на йонообменници тип Chilex, които, за разлика от стъклото, не сорбират ДНК, а по-скоро примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и сорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

По този начин изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се вземе предвид с разбирането на целите на планирания анализ.

1.5.6 Усилване

За да се извърши реакцията на амплификация, е необходимо да се подготви реакционна смес и да се добави анализираната ДНК проба към нея. Важно е да се вземат предвид някои характеристики на отгряването на праймера. Факт е, че по правило анализираната биологична проба съдържа различни ДНК молекули, към които праймерите, използвани в реакцията, имат частична, а в някои случаи значителна хомоложност. В допълнение, праймерите могат да се отгряват един към друг, образувайки димери на праймера. И двете водят до значителна консумация на праймери за синтеза на странични (неспецифични) реакционни продукти и в резултат значително намаляват чувствителността на системата. Това прави трудно или невъзможно разчитането на резултатите от реакцията по време на електрофореза.

1.6 Състав на стандартната PCR реакционна смес

x PCR буфер (100 mM разтвор на Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM разтвор на KCl, 25 mM разтвор на MgCl2 ) …….2,5 µl

Вода (MilliQ)………………………………………………………….18,8 µl

Смес от нуклеотидни трифосфати (dNTPs)

mM разтвор на всеки…………………………………….……….0,5 µl

Праймер 1 (10 mM разтвор) ………………………………………………………..1 µl

Праймер 2 (10 mM разтвор) ………………………………………………………..1 µl

ДНК полимераза (5 единици/µl) ………………………………………0,2 µl

ДНК проба (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Оценка на резултатите от реакцията

За да оцените правилно резултатите от PCR, е важно да разберете, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити с помощта на електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което не се случва често в живота. Особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията има степента на чистота на ДНК препарата, т.е. наличието в реакционната смес на определени инхибитори, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, дори десетки хиляди целеви ДНК молекули не могат да бъдат амплифицирани. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Глава 2: Приложения на полимеразната верижна реакция

PCR се използва в много области за тестване и научни експерименти.

Криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените „генетични пръстови отпечатъци“. Необходима е проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, семенна течност, коса и др. Сравнява се с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично едно копие. ДНК се разгражда на фрагменти и след това се амплифицира с помощта на PCR. Фрагментите се разделят с помощта на ДНК електрофореза. Полученият модел на подреждането на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

Установяване на бащинство

Резултати от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани чрез PCR. баща. дете. Майка. Детето е наследило някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което води до нов, уникален отпечатък.

Въпреки че генетичните пръстови отпечатъци са уникални, семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез няколко пръстови отпечатъка. Същият метод може да се приложи, леко модифициран, за установяване на еволюционна връзка между организмите.

Медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Интересуващият ген се амплифицира чрез PCR с помощта на подходящи праймери и след това се секвенира за идентифициране на мутации. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите.

Персонализирана медицина

Понякога лекарствата се оказват токсични или алергични за някои пациенти. Причините за това отчасти се дължат на индивидуалните различия в чувствителността и метаболизма на лекарствата и техните производни. Тези различия се определят на генетично ниво. Например при един пациент даден цитохром може да е по-активен, при друг - по-малко. За да се определи какъв тип цитохром има даден пациент, се препоръчва да се проведе PCR анализ преди употреба на лекарството. Този анализ се нарича предварително генотипиране.

Генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор - част от ДНК, която прехвърля чужд ген в същия или друг удобен за отглеждане организъм. Например плазмиди или вирусна ДНК се използват като вектори. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукта от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин много протеини се получават в индустриални количества за използване в селско стопанство, медицина и др.

ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ дидезоксинуклеотиди, маркирани с флуоресцентен етикет или радиоактивен изотоп, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията производните на нуклеотиди, маркирани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди, след като синтезираните вериги са разделени в гела.

Мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за извършване на мутагенеза. Използването на PCR направи възможно да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

PCR методът направи възможно анализирането на наличието на последователности на човешки папиломен вирус в вградени в парафин биопсични срезове на човешки цервикални тумори 40 години преди това изследване. Освен това, използвайки PCR, беше възможно да се амплифицират и клонират фрагменти от митохондриална ДНК от фосилните останки на 7 хиляди годишен човешки мозък!

Използвайки лизати на отделни човешки сперматозоиди, беше демонстрирана способността за едновременно анализиране на два локуса, разположени на различни нехомоложни хромозоми. Този подход предоставя уникална възможност за фин генетичен анализ и изследване на хромозомна рекомбинация, ДНК полиморфизъм и т.н. Методът за анализ на индивидуална сперма веднага беше открит практическа употребав съдебната медицина, тъй като HLA типизирането на хаплоидни клетки прави възможно определянето на бащинството или идентифицирането на престъпника (HLA комплексът е набор от гени на основния човешки комплекс за хистосъвместимост; локусите на HLA комплекса са най-полиморфните от всички известни в висши гръбначни: в рамките на един вид във всеки локус има необичайно голям брой различни алели - алтернативни форми на един и същ ген).

С помощта на PCR е възможно да се определи правилната интеграция на чужди генетични структури в предварително определен регион на генома на изследваните клетки. Общата клетъчна ДНК се свързва с два олигонуклеотидни праймера, единият от които е комплементарен на част от ДНК на гостоприемника близо до точката на вмъкване, а другият на последователността на интегрирания фрагмент в антипаралелната ДНК верига. Полимеразната верижна реакция, в случай на непроменена хромозомна ДНК структура на предвиденото място за вмъкване, води до образуването на едноверижни ДНК фрагменти с неизвестен размер, а в случай на планирано вмъкване, двойно-верижни ДНК фрагменти от известен размер, определен от разстоянието между местата на отгряване на два праймера. Освен това степента на амплификация на анализирания регион на генома в първия случай ще бъде линейно зависима от броя на циклите, а във втория случай ще бъде експоненциална. Експоненциалното натрупване на амплифициран фрагмент с предварително определен размер по време на PCR ни позволява да го наблюдаваме визуално след електрофоретично фракциониране на ДНК препарата и да направим недвусмислено заключение за вмъкването на чужда последователност в дадена област на хромозомна ДНК.

Заключение

PCR методът в момента е най-широко използван като метод за диагностициране на различни инфекциозни заболявания. PCR ви позволява да идентифицирате етиологията на инфекцията, дори ако пробата, взета за анализ, съдържа само няколко ДНК молекули на патогена. PCR се използва широко в ранната диагностика на HIV инфекции, вирусни хепатити и др. Днес почти няма инфекциозен агент, който да не може да бъде открит чрез PCR.

Списък на използваната литература

1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методи за молекулярно-генетичен анализ. - Мн.: Унипол, 2007. - 176 с.

2.PCR "в реално време" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и т.н.; редактиран от д.б. н. Д.В. Ребрикова; предговор Ел Ей Остерман и акад RAS и RAAS E.D. Свердлов; 2-ро издание, рев. и допълнителни - М.: БИНОМ. Лаборатория Знание, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Изкуствени генетични системи. - М.: Наука, 2005. - В 2 т.

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярна биотехнология. Принципи и приложения 589 стр., 2002

5.Щелкунов С.Н. Генното инженерство. - Новосибирск: Сиб. Унив. издателство, 2004. - 496 с.

Редактирано от A.A. Ворбьева „Полимеразна верижна реакция и нейното приложение за диагностика в дерматовенерологията”; Медицинска информационна агенция - 72 страници

http://ru. wikipedia.org

http://учен. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. су/ - медицински журнал

Обучение

Нуждаете се от помощ при изучаване на тема?

Нашите специалисти ще съветват или предоставят услуги за обучение по теми, които ви интересуват.
Изпратете вашата кандидатурапосочване на темата точно сега, за да разберете за възможността за получаване на консултация.

За адекватно и ефективно лечениеМного инфекциозни заболявания изискват своевременно идентифициране точна диагноза. За решаването на този проблем днес се използват високотехнологични диагностични методи, базирани на методите на молекулярната биология. В момента полимеразната верижна реакция (PCR) вече се използва доста широко в практическата медицина като най-надеждното лабораторно диагностично средство.

Какво обяснява популярността на PCR в момента?

Първо, този метод се използва за идентифициране на патогени на различни инфекциозни заболявания с висока точност.

На второ място, за наблюдение на ефективността на лечението.

В различни ръководства, брошури, статии, както и разяснения на медицински специалисти, често срещаме използването на неразбираеми термини и думи. Наистина е трудно да се говори за високотехнологични продукти на науката с ежедневни думи.

Каква е същността и механиката на PCR диагностиката?

Всеки жив организъм има свои уникални гени. Гените се намират в молекулата на ДНК, която всъщност е „визитната картичка“ на всеки отделен организъм. ДНК (генетичен материал) е много дълга молекула, която се състои от градивни елементи, наречени нуклеотиди. За всеки патоген на инфекциозни заболявания те са разположени строго специфично, тоест в определена последователност и комбинация. Когато е необходимо да се разбере дали човек има определен патоген, се взема биологичен материал (кръв, урина, слюнка, намазка), който съдържа ДНК или ДНК фрагменти на микроба. Но количеството генетичен материал на патогена е много малко и е невъзможно да се каже към кой микроорганизъм принадлежи. PCR се използва за решаване на този проблем. Същността на полимеразната верижна реакция е, че се взема малко количество материал за изследване, съдържащ ДНК, и по време на процеса на PCR количеството генетичен материал, принадлежащ на специфичен патоген, се увеличава и по този начин той може да бъде идентифициран.

PCR диагностика - генетично изследване на биоматериал.

Идеята за PCR метода принадлежи на американския учен К. Мълинс, който той предложи през 1983 г. Въпреки това, той получи широко клинично приложение едва в средата на 90-те години на 20 век.

Нека разберем терминологията, какво е това - ДНК и т.н. Всяка клетка на всяко живо същество (животно, растение, човек, бактерия, вирус) има хромозоми. Хромозомите са пазители на генетична информация, която съдържа цялата генна последователност на всяко конкретно живо същество.

Всяка хромозома се състои от две нишки на ДНК, усукани в спирала една спрямо друга. ДНК е химически дезоксирибонуклеинова киселина, която се състои от структурни компоненти - нуклеотиди. Има 5 вида нуклеотиди - тимин (Т), аденозин (А), гуанин (G), цитозин (С) и урацил (U). Нуклеотидите се подреждат един след друг в строго индивидуална последователност, образувайки гени. Един ген може да се състои от 20-200 такива нуклеотида. Например, генът, кодиращ производството на инсулин, се състои от 60 нуклеотидни двойки.

Нуклеотидите имат свойството на комплементарност. Това означава, че срещу аденин (А) в една верига на ДНК задължително има тимин (Т) в друга верига, а срещу гуанин (G) има цитозин (С). Схематично това изглежда така:
G - C
Т - А
А - Т
Това свойство на комплементарност е ключово за PCR.

В допълнение към ДНК, РНК има същата структура - рибонуклеинова киселина, която се различава от ДНК по това, че използва урацил вместо тимин. РНК е пазител на генетична информация в някои вируси, наречени ретровируси (например ХИВ).

Молекулите на ДНК и РНК могат да се „умножават“ (това свойство се използва за PCR). Това се случва по следния начин: две вериги на ДНК или РНК се отдалечават една от друга и върху всяка нишка се намира специален ензим, който синтезира нова верига. Синтезът протича на принципа на комплементарността, т.е. ако първоначалната ДНК верига съдържа нуклеотид А, то новосинтезираният ще съдържа Т, ако G, тогава С и т.н. За да започне синтеза, този специален ензим "строител" се нуждае от "семе" - последователност от 5-15 нуклеотида. Този „праймер“ е дефиниран за всеки ген (ген на хламидия, микоплазма, вируси) експериментално.

И така, всеки PCR цикъл се състои от три етапа. В първия етап се случва така нареченото размотаване на ДНК - тоест разделянето на две ДНК вериги, свързани една с друга. Във втория "семето" е прикрепено към част от ДНК веригата. И накрая, удължаването на тези ДНК вериги, което се произвежда от „изграждащ“ ензим. В момента всичко това труден процеспротича в една епруветка и се състои от повтарящи се цикли на размножаване на откриваема ДНК с цел получаване на голям брой копия, които след това могат да бъдат открити с конвенционални методи. Тоест от една верига на ДНК получаваме стотици или хиляди.

Етапи на PCR изследване

Вземане на биологичен материал за изследване

Като проба се използва различен биологичен материал: кръв и нейните компоненти, урина, слюнка, секрет от лигавицата, цереброспинална течност, секрет раневи повърхности, съдържанието на телесните кухини. Всички биопроби се събират с инструменти за еднократна употреба, като събраният материал се поставя в пластмасови стерилни епруветки или се поставя върху хранителна среда с последващо транспортиране до лабораторията.

Необходимите реагенти се добавят към събраните проби и се поставят в програмируем термостат - термоциклер (усилвател). В усилвателя PCR цикълът, състоящ се от три етапа (денатурация, отгряване и удължаване), се повтаря 30-50 пъти. Какво означава това? Нека да разгледаме по-отблизо.

Етапи на директна PCR реакция, копиране на генетичен материал

азPCR етап - Подготовка на генетичен материал за копиране.
Възниква при температура от 95 ° C, докато нишките на ДНК се разделят и „семената“ могат да кацнат върху тях.

„Семената“ се произвеждат промишлено от различни изследователски и производствени асоциации, а лабораториите купуват готови. В същото време „праймерът“ за идентифициране например на хламидия работи само за хламидия и т.н. По този начин, ако биоматериалът се тества за наличие на хламидийна инфекция, тогава в реакционната смес се поставя "праймер" за хламидия; ако биоматериалът е тестван за вируса на Epstein-Barr, тогава той също е „семе“ за вируса на Epstein-Barr.

IIетап – Комбиниране на генетичния материал на инфекциозния агент и „семето“.
Ако има ДНК на откриваем вирус или бактерия, „праймерът“ се намира върху тази ДНК. Този процес на добавяне на "праймер" е вторият етап на PCR. Този етап протича при температура 75°C.

IIIетап - Копиране на генетичния материал на инфекциозния агент.
Това е процес на действително удължаване или умножаване на генетичен материал, който се случва при 72°C. Ензимът „строител“ се доближава до „семената“ и синтезира нова ДНК верига. С края на синтеза на нова ДНК верига завършва PCR цикълът. Тоест в един PCR цикъл количеството генетичен материал се удвоява. Например, първоначалната проба съдържа 100 ДНК молекули на вирус; след първия PCR цикъл пробата вече ще съдържа 200 ДНК молекули на тествания вирус. Един цикъл е с продължителност 2-3 минути.

За генериране на достатъчно количество генетичен материал за идентификация обикновено се извършват 30-50 PCR цикъла, което отнема 2-3 часа.

Етап на идентификация на размножения генетичен материал

Всъщност PCR свършва тук и след това идва не по-малко значимият етап на идентификация. За идентификация се използва методът на електрофореза или етикетирани „семена“. Когато се използва електрофореза, получените ДНК вериги се разделят по размер и наличието на ДНК фрагменти с различна дължина показва положителен резултат от теста (т.е. наличието на конкретен вирус, бактерия и др.). Когато се използват етикетирани „семена“, към крайния реакционен продукт се добавя хромоген (багрило), в резултат на което ензимната реакция се придружава от образуването на цвят. Развитието на цвета директно показва, че в оригиналната проба присъства вирус или друг откриваем агент.

Днес, използвайки етикетирани „семена“, както и подходящ софтуер, е възможно незабавно да „четете“ резултатите от PCR. Това е така нареченият PCR в реално време.

Защо PCR диагностиката е толкова ценна?

Едно от съществените предимства на PCR метода е неговата висока чувствителност – от 95 до 100%. Тези обезщетения обаче трябва да се основават на стриктното спазване на следните условия:

1. правилно събиране и транспортиране на биологичен материал;
2. наличие на стерилни инструменти за еднократна употреба, специални лаборатории и обучен персонал;
3. стриктно спазване на методологията и стерилност по време на анализа

Чувствителността варира при различните открити микроби. Например, чувствителността на PCR метода за откриване на вируса на хепатит С е 97-98%, чувствителността за откриване на уреаплазма е 99-100%.

Възможностите, присъщи на PCR анализа, позволяват ненадмината аналитична специфичност. Това означава да се идентифицира точно търсеният микроорганизъм, а не подобен или тясно свързан.
Диагностична чувствителности специфичността на метода PCR често превъзхождат тези на метода на културата, наречен „златен стандарт“ за откриване на инфекциозни заболявания. Като се има предвид продължителността на култивирането на културата (от няколко дни до няколко седмици), предимството на PCR метода става очевидно.

PCR в диагностиката на инфекции
Предимствата на PCR метода (чувствителност и специфичност) определят широк спектър от приложения в съвременната медицина.
Основните области на приложение на PCR диагностиката:

1. диагностика на остри и хронични инфекциозни заболявания с различна локализация
2. наблюдение на ефективността на терапията
3. изясняване на вида на патогена

PCR се използва в акушерството, гинекологията, неонатологията, педиатрията, урологията, венерологията, нефрологията, инфекциозната клиника, офталмологията, неврологията, фтизиопулмологията и др.

Използването на PCR диагностика се извършва заедно с други изследователски методи (ELISA, PIF, RIF и др.). Тяхната комбинация и целесъобразност се определят от лекуващия лекар.

Инфекциозни агенти, открити чрез PCR

Вируси:

1. ретровируси HIV-1 и HIV-2
2. херпетиформни вируси
3. вирус херпес симплекс 1 и 2 вида

Наскоро надежден, високочувствителен и бърз методдиагностика на различни човешки инфекциозни заболявания. Този метод се нарича "PCR анализ". Какво представлява, каква е същността му, какви микроорганизми може да идентифицира и как да го приемате правилно, ще ви кажем в нашата статия.

История на откритието

PCR методите се използват и при диагностицирането на рак.

Предимства на метода

PCR диагностиката има редица предимства:

1. Висока чувствителност. Дори ако присъстват само няколко ДНК молекули на микроорганизми, PCR анализът определя наличието на инфекция. Методът ще помогне при хронични и латентни заболявания. Често в такива случаи микроорганизмът не може да се култивира по друг начин.
2. Всеки материал е подходящ за изследване, например слюнка, кръв, генитални секрети, коса, епителни клетки. Най-често срещаният е PCR тестът на кръвта и урогениталната цитонамазка.

   

3. Не се изисква дългосрочно отглеждане на култури. Автоматизираният диагностичен процес ви позволява да получите резултатите от изследването след 4-5 часа.
4. Методът е почти сто процента надежден. Регистрирани са само отделни случаи на фалшиво отрицателни резултати.
5. Възможност за идентифициране на няколко вида патогени от една проба материал. Това не само ускорява процеса на диагностициране на заболяването, но и значително намалява материалните разходи. Често лекарят предписва сложен PCR тест. Цената на преглед, състоящ се от идентифициране на шест патогена, е около 1500 рубли.

За да бъдат резултатите надеждни при провеждане на PCR изследване, трябва да вземете теста, като следвате препоръките за предварителна подготовка за диагностика:

1. Преди да дарите слюнка, трябва да се въздържате от ядене и приемане на лекарства 4 часа преди събирането на материала. Непосредствено преди процедурата изплакнете устата си с преварена вода.
2. Горните правила трябва да се спазват и при вземане на проба от вътрешната повърхност на бузата. След изплакване е препоръчително да направите лек масаж на кожата, за да освободите секрета на жлезата.
3. Урината обикновено се събира у дома. За да направите това, трябва да почистите добре гениталиите. 50-60 ml урина трябва да се съберат в стерилен пластмасов контейнер. За да се гарантира чистотата на материала, се препоръчва жените да поставят тампон във влагалището, а мъжете да отдръпнат максимално кожната гънка. Не можете да дарявате материал по време на менструалния цикъл.
4. За да дарите сперма, трябва да се въздържате от полов акт в продължение на 3 дни преди събирането на материала. Лекарите съветват също така да се избягва посещението на сауна и гореща вана, пиенето на алкохол и пикантни храни. Трябва да се въздържате от уриниране 3 часа преди изследването.
5. Например, ако се проведе PCR тест за хламидия, както на жените, така и на мъжете се препоръчва сексуална почивка в продължение на 3 дни. 2 седмици преди изследването не трябва да приемате антибактериални лекарства. За една седмица трябва да спрете да използвате интимни гелове, мехлеми, вагинални супозитории и душове. 3 часа преди теста трябва да се въздържате от уриниране. По време на менструация материал не се взема, само 3 дни след спиране на кървенето може да се вземе урогенитална намазка.

PCR по време на бременност

Докато чакате бебе, много полово предавани инфекциозни болести са изключително опасни за нормално развитиеплода Полово предаваните болести могат да причинят вътрематочно забавяне на растежа, спонтанен аборт или преждевременно раждане и вродени дефекти на детето. Ето защо е изключително важно да отидете на ранни стадииизследване на бременността чрез PCR метод. Тестът се прави при регистрация - до 12 седмици.



Материалът се събира от цервикалния канал с помощта на специална четка. Процедурата е безболезнена и не представлява опасност за бебето. Обикновено по време на бременност се извършва анализ за хламидия чрез PCR метод, както и за уреаплазмоза, микоплазмоза, цитомегаловирус, херпес и папиломен вирус. Този набор от изследвания се нарича PCR-6.

PCR за диагностика на ХИВ

Поради факта, че методът е много чувствителен към промените в тялото и диагностичните условия, много фактори могат да повлияят на резултата. Следователно PCR анализът за HIV инфекция не е надежден метод, неговата ефективност е 96-98%. В останалите 2-4% от случаите тестът дава фалшиво положителни резултати.

Но в някои ситуации не можете да правите без PCR диагностика на ХИВ. Обикновено се извършва при хора с фалшиво отрицателен резултат от ELISA. Такива показатели показват, че човек все още не е развил антитела срещу вируса и те не могат да бъдат открити без многократно увеличаване на броя. Точно това може да се постигне чрез извършване на кръвен тест по метода PCR.

Такава диагностика е необходима и за деца през първата година от живота, родени от ХИВ-позитивна майка. Методът е единствения начиннадеждно определяне на състоянието на детето.

PCR за диагностициране на хепатит

Методът на полимеразна верижна реакция ви позволява да откриете ДНК на вируса на хепатит А, В, С много преди образуването на антитела срещу инфекцията или появата на симптоми на заболяването. PCR тестът за хепатит С е особено ефективен, тъй като в 85% от случаите това заболяване е асимптоматично и без навременно лечение става хронично.



Навременното откриване на патогена ще помогне да се избегнат усложнения и дългосрочно лечение.

Цялостно PCR изследване

Цялостен PCR анализ: изследване с помощта на метода на полимезна верижна реакция, който включва едновременно определяне на няколко вида инфекции: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, цитомегаловирус, херпес тип 1 и 2, гонорея, папиломавирус. Цената на такава диагностика варира от 2000 до 3500 рубли. в зависимост от клиниката, използваните материали и оборудване, както и вида на анализа: качествен или количествен. Лекарят ще реши кое е необходимо във вашия случай. В някои случаи е достатъчно просто да се определи наличието на патогена, в други, например при HIV инфекция, количественият титър играе важна роля. При диагностициране на всички горепосочени патогени, изследването се нарича „PCR-12 анализ“.

Декодиране на резултатите от анализа

Дешифрирането на PCR анализа не е трудно. Има само 2 индикаторни скали - “ положителен резултат" и "отрицателен резултат". Ако се открие патоген, лекарите могат да потвърдят наличието на болестта с 99% увереност и да започнат лечението на пациента. При количествения метод за определяне на инфекцията цифровият показател на откритите бактерии ще бъде посочен в съответната колона. Само лекар може да определи степента на заболяването и да предпише необходимото лечение.



В някои случаи, например при определяне на HIV инфекцията с помощта на PCR метода, ако резултатът е отрицателен, е необходимо да се проведат допълнителни изследвания за потвърждаване на получените показатели.

Къде мога да се изследвам?

Къде да направите PCR тест: в държавна клиника или в частна лаборатория? За съжаление в общинските лечебни заведения оборудването и методите често са остарели. Ето защо е по-добре да се даде предпочитание на частни лаборатории с модерно оборудване и висококвалифициран персонал. Освен това в частна клиника ще получите резултат много по-бързо.

В Москва много частни лаборатории предлагат PCR тестове за различни инфекции. Например, в такива клиники като "Вита", "Комплексна клиника", "Щастливо семейство", "Уро-Про" се извършва PCR анализ. Цената на прегледа е от 200 рубли. за идентифициране на един патоген.

Може да се заключи, че диагностицирането на инфекциозни заболявания с помощта на метода PCR в повечето случаи е бърз и надежден начин за откриване на патогена в тялото в ранните стадии на инфекцията. Но все пак в някои случаи си струва да изберете други диагностични методи. Само специалист може да определи необходимостта от такова изследване. Дешифрирането на PCR анализа също изисква професионален подход. Следвайте препоръките на Вашия лекар и не правете сами ненужни изследвания.