Komplemento fiksavimo reakcija(RSC) yra sudėtinga dviejų pakopų serologinė reakcija. Jame naudojami penki ingredientai, sudarantys dvi sistemas: antigenas, antikūnas, komplementas (pirmoji sistema); avių eritrocitai, įjautrinti (gydomi) hemoliziniu serumu, turinčiu jiems specifinių antikūnų (antroji, arba indikatorinė, hemo sistema). Šiuo atveju antikūno sąveika su antigenu pirmoje reakcijos stadijoje sukelia imuninio komplekso, kuris adsorbuoja komplementą, susidarymą, tačiau to neįmanoma aptikti vizualiai. Antrame etape hemo sistema naudojama kaip komplemento fiksacijos indikatorius ant antigeno-antikūno komplekso, kuris, būdamas imuninis kompleksas, taip pat gali jį adsorbuoti. Galiausiai yra dvi galimos reakcijos pasekmės. Jei antikūnas ir antigenas atitinka vienas kitą, o susidaręs kompleksas adsorbuoja komplementą, hemo sistemos eritrocitų lizė neįvyks. Jei antikūnas nesutampa su antigenu ir atvirkščiai, likęs laisvas komplementas prisijungs prie hemo sistemos ir sukels hemolizę.

Kaip ir kiti serologiniai tyrimai, RSA gali būti naudojamas aptikti specifinius antikūnus iš žinomo antigeno arba aptikti antigeną iš žinomų antikūnų.

bendrosios charakteristikos RSK ingredientai.

1. Prieš atliekant reakciją, tiriamas SERUMAS kaitinamas vandens vonioje 30 minučių, kad inaktyvuotų savo komplementą, ir skiedžiamas nuo 1:5.

2. ANTIGENU gali būti bakterijų kultūros, jų lizatai, virusai ir virusų turinčios medžiagos, patologiškai pakitusių organų ir audinių lipidų ekstraktai.

3. KOMPLEMENTAS – eksperimento dieną gautas jūrų kiaulytės serumas. Šiuo metu naudojamas pramoninis sausas priedas.

4. HEMOLITINĖ SISTEMA susideda iš hemolizinio serumo ir 3% avies raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos, sumaišytos vienodais tūriais. Norint jautrinti eritrocitus hemolizinais, mišinys 30 minučių laikomas termostate 37°C temperatūroje.

Pagrindinio RSC eksperimento nustatymas. SERUMAS, ANTIGENAS IR KOMPLEMENTAS pilamas į 1 mėgintuvėlį, serumas, komplementas ir vietoj antigeno į antrąjį mėgintuvėlį pilamas izotoninis natrio chlorido tirpalas (SERUMO KONTROLĖ), į trečią mėgintuvėlį pilamas antigenas, komplementas ir tas pats natrio chlorido tirpalas ( ANTIGENŲ KONTROLĖ). Mėgintuvėliai 1 valandai dedami į 37°C temperatūros termostatą. Tuo pačiu metu paruošiama hemolizinė sistema, kuri, nuėmus stovą nuo termostato, pridedama prie visų trijų vamzdelių. Sumaišius brangakmenių sistemą su trijų mėgintuvėlių ingredientais, pastarieji vėl dedami į termostatą 1 valandai, o po šio laiko atsižvelgiama į RSK rezultatus.

Atsižvelgiant į RSC, reakcijos intensyvumas nurodomas pliusais: „++++“ – smarkiai teigiama reakcija visiškai atidus hemolizei, skystis mėgintuvėlyje yra bespalvis, visi raudonieji kraujo kūneliai nusėdo apačioje; „+++“, „++“ – teigiama reakcija, kuriai būdingas skysčio spalvos padidėjimas dėl hemolizės ir raudonųjų kraujo kūnelių skaičiaus sumažėjimas nuosėdose; „+“ – silpnai teigiama reakcija, skystis yra intensyvios spalvos, vamzdelio apačioje yra nedidelis kiekis raudonųjų kraujo kūnelių. Neigiama reakcijažymimas ženklu „–“, šiuo atveju stebima visiška hemolizė, skystis mėgintuvėlyje yra intensyviai rausvos spalvos („lako kraujas“).

RSC yra labai sudėtinga, bet labai jautri specifinė reakcija. Plačiai naudojamas sifiliui diagnozuoti, lėtinė forma gonorėja, kokliušas, aktinomikozė, visos riketsiozės ir virusinės infekcijos.

Susietas imunosorbento tyrimas.

Metodą aštuntojo dešimtmečio pradžioje savarankiškai sukūrė trys mokslininkų grupės. Metodas panašus į RIA, tačiau jis pagrįstas Ag arba Ab, kuris patenka į reakciją su fermentu, žymėjimu. Etiketės judėjimą su substratu dažniausiai lydi terpės spalvos pasikeitimas. Šiuo metu yra sukurta daugybė šio metodo modifikacijų, tačiau plačiausiai naudojamas heterogeninis kietosios fazės ELISA (kietos fazės). Yra:

1) TIESIOGINĖ KIETOS FAZĖS ELISA. Tokiu atveju:

1. serumas su Ab inkubuojamas su Ag, fiksuotu ant kieto substrato (dažniausiai tai yra plastikinė mikroplokštelė).

2. Abs, kurie nesurišo Ag, pašalinami pakartotinai plaunant.

3. Į Abs, kurie surišo Ag, pridedamas fermentu pažymėtas serumas.

4. Nustatykite žymenų fermentų, susietų su At, skaičių.

2) KONKURENCINGA KIETOS FAZĖS ELISA.

1. Įpilkite išrūgų. Jei jame yra specifinių Abs, tada jie jungiasi su Ags, pritvirtintais ant kieto pagrindo. Jei konkrečių Abs nėra, Ag atrodo nesurištas.

2. Pridedant fiksuotam Ag būdingus antikūnus, pirmuoju atveju jie neturės su kuo sąveikauti (dauguma Ag jau yra susieti) Þ žymeklio kiekis mažas. Antruoju atveju specifiniai Abs prisijungs prie Ag ir skalbimo metu jie nebus nuplauti Þ didelis žymenų kiekis.

Panašus į m.b. ANTIKŪNAI yra fiksuoti, o įvairios įmonės gamina tabletes su jau fiksuotais antikūnais.

Palyginti su klasikiniai metodai aptikdamas Ag, šis metodas leidžia tiesiogiai užfiksuoti jų sąveiką su Ab, o ne antrines apraiškas (agliutinaciją, kritulius ar hemolizę). Metodas labai JAUTRUS (pakanka 1ng/ml koncentracijos).

Nustatykite: chlamidijos, klostridijos, ŽIV ir kt.

8. Fagocitozės reakcija.

Fagocitozę vykdo mikrofagai ir makrofagai. Fagocitozės stadijos: priartėjimas, sukibimas, panardinimas, virškinimas.

Fagocitinių ląstelių funkcinio aktyvumo įvertinimas.

Kiekis Granulocitų ir monocitų fagocitinis aktyvumas vertinamas visame kraujyje, leukocitų suspensijoje arba praturtintose fagocitinių ląstelių frakcijose. Standartiniais fagocitozės objektais naudojamos 1,0-2,0 mikronų skersmens monodispersinės latekso dalelės, karščiu žudytų bakterijų ar į mieles panašių grybų suspensija.

Fagocitai sumaišomi su fagocituota medžiaga santykiu 1:10 arba 1:100 ir nuolat maišant inkubuojami 37°C temperatūroje 30 minučių. Tada mėgintuvėliai centrifuguojami, o nuosėdos resuspenduojamos kraujo serumo laše, kad būtų paruoštas tepinėlis. Tepinėliuose, fiksuotuose May-Chrunwald dažu ir nudažytuose pagal Romanovsky-Giemsa metodą, apskaičiuojamas fagocitinių ląstelių procentas (FP – fagocitinis indikatorius) ir absorbuotų dalelių skaičius 1 ląstelėje (PF – fagocitinis skaičius).

U sveikas žmogus FP=40-80%, FP=1-5.

9. Diagnostika.

Diagnostika yra tam tikrų mikrobų ląstelių, nužudytų karščiu arba formalinu, suspensija, kurios ląstelių kiekis tūrio vienete yra žinomas. Gyvų bakterijų suspensijos taip pat gali būti naudojamos kaip antigenas. Reakcijos reiškinys preliminariai pasirodo po dviejų valandų (esant 37 0 C), galutinis rezultatas atsižvelgiama į kambario temperatūrą po 18-20 valandų. Diagnozei teigiamą reakciją domina tik tam tikras serumo titras, kuris yra diagnostinis. Taigi bruceliozės diagnostinis titras yra 1:200, o tula-remia - 1:100. Norėdami aptikti antikūnus, galite atlikti ekspresinius agliutinacijos testus (apskaitos laikas yra kelios minutės). Pavyzdžiui: 1. Kraujo lašelių reakcija sergant tuliaremija. Ant specialios stiklinės paciento viso kraujo lašas užlašinamas lašeliu distiliuoto vandens (skirto hemolizei) ir lašeliu diagnostinės tularemijos. Reakcija įvyksta per 1-2 minutes, aiškiai matomi agliutinatai balkšvų gabalėlių pavidalu. 2. Dėl bruceliozės ant stiklo atliekama ekspresinė Heddelsono agliutinacijos reakcija.

Šios reakcijos neleidžia nustatyti antikūnų kiekio serume b) identifikuoti gryną infekcinių ligų sukėlėjų kultūrą. Šiuo tikslu naudojami imuninės diagnostikos testai.

agliutinuojantys serumai, pagaminti vakcinų ir serumo institutų imunizuojant gyvūnus ištisomis mikrobų ląstelėmis. Serumo autentiškumui užtikrinti geriau naudoti adsorbuotus, kad juose būtų tik tam tikrą mikroorganizmo rūšį ar tipą atitinkantys antikūnai.

Imuninio serumo gavimo principai.

Imuninis serumas (antiserumas) yra kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš tam tikrą antigeną. Daugeliu atvejų imuniniai (diagnostikos) serumai prieš mikrobų, audinių ir kitus antigenus gaunami eksperimentiniu būdu imunizuojant gyvūnus atitinkamais antigenais.

Tarp pagrindinių reikalavimų antiserumui yra didelis jų specifiškumas ir pakankamas antikūnų kiekis. Pagal specifiškumą antiserumai išskiriami į polivalentinius (polispecifinius) ir monovalentinius (monospecifinius) antiserumus. Daugiavalenčiuose serumuose yra antikūnų prieš daugelį antigenų, monospecifiniuose – prieš vieną specifinį antigeną. Galite įsigyti monospecifinių serumų:

1) naudojant labai išgrynintus antigenus gyvūnams imunizuoti,

2) natūralių serumų išvalymas nuo nepageidaujamo specifiškumo antikūnų.

Šiam naudojimui:

1) imunoafiniteto metodas, pagrįstas tam tikro specifiškumo antikūnų surišimu atitinkamais antigenais, imobilizuotais ant kietosios fazės nešiklio, po to atskyrimu gautų antigeno-AB kompleksų ir antikūnų išskyrimu;

2) Castellani adsorbcijos metodas. Šiuo tikslu mikroorganizmai, kurie apima visus grupės antigenai, tokiu būdu adsorbuojant homologinį anti-

kūnai. Tokiuose adsorbuotuose monospecifiniuose antiserumuose yra antikūnų prieš įvairius antigeno molekulės determinantus, kurie yra nevienalyčiai pagal klasę (poklasį).

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) yra ta, kad kai antigenai ir antikūnai atitinka vienas kitą, jie sudaro imuninį kompleksą, prie kurio komplementas (C) yra prijungtas per antikūnų Fc fragmentą, t. y. komplementą jungia antigeno-antikūno kompleksas. Jei antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro, komplementas lieka laisvas.

Specifinę AG ir AT sąveiką lydi komplemento adsorbcija (susirišimas). Kadangi komplemento fiksavimo procesas nėra vizualiai akivaizdus, ​​J. Bordet ir O. Zhangu pasiūlė kaip indikatorių naudoti hemolizinę sistemą (avies raudonieji kraujo kūneliai + hemolizinis serumas), parodantį, ar komplementą fiksuoja AG-AT kompleksas. Jei AG ir AT atitinka vienas kitą, t.y. susiformavo imuninis kompleksas, tai su šiuo kompleksu susijungia komplementas ir hemolizė nevyksta. Jei AT neatitinka AG, tai kompleksas nesusidaro ir komplementas, likęs laisvas, jungiasi su antrąja sistema ir sukelia hemolizę.

Reakcijos eiga

Reakcija vyksta dviem fazėmis, kuriose dalyvauja dvi sistemos; bakterinė ir hemolizinė. Pirmoji reakcija (specifinė) apima antigeną 4-+ antikūną + komplementą. Teigiamas reakcijos rezultatas, atsirandantis, kai antikūnai sutampa su antigenu, pasižymi specifinio bakterinio antigeno-antikūno komplekso susidarymu su adsorbuotu, arba, kaip sakoma, „surištu“ komplementu. Likęs nematomas, kompleksas nesukelia jokių išoriniai pokyčiai aplinka, kurioje jis susiformavo. Neigiamas RSC rezultatas atsiranda nesant specifinio afiniteto tarp antigeno ir serumo antikūno ir jam būdingas laisvo aktyvaus komplemento išsaugojimas. Pirmoji RSC fazė gali būti atliekama termostate esant 37°C (1-2 val.) arba šaldytuve 3-4°C (18-20 valandų). Ilgai formuojantis antigeno-antikūno imuniniam kompleksui šaltyje, atsiranda pilnesnis komplemento surišimas ir dėl to padidėja reakcijos jautrumas. Atlikdamas lyginamuosius eksperimentus, sovietų imunologas akademikas. V.Ioffe ir jo mokiniai parodė, kad esant ilgalaikei komplemento fiksacijai šaltyje, galima užfiksuoti 100–500 kartų mažesnį antigeno kiekį ir gauti teigiamų rezultatų naudojant didesnį imuninio serumo praskiedimą, nei atliekant komplemento fiksavimo eksperimentą, esant temperatūrai 37 ° C temperatūroje 1-2 valandas. Antroji reakcijos fazė (orientacinė) vyksta tarp hemolizinės sistemos reagentų (3% eritrocitų suspensijos ir hemolizinio serumo vienodais kiekiais) 37 °C temperatūroje. tik esant komplementui, kuris lieka laisvas nuo pirmosios reakcijos fazės (neigiama reakcija) . Nesant laisvo aktyvaus komplemento, raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė, veikiant specifiniams hemolizinams, nevyksta (reakcija yra teigiama).

Komponentai

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) yra sudėtinga serologinė reakcija. Jai atlikti reikalingi 5 ingredientai, būtent: AG, AT ir komplementas (pirmoji sistema), avių eritrocitai ir hemolizinis serumas (antroji sistema).

CSC antigenu gali būti įvairių nužudytų mikroorganizmų kultūros, jų lizatai, bakterijų komponentai, patologiškai pakitę ir normalūs organai, audinių lipidai, virusai ir virusų turinčios medžiagos.

Šviežios arba sausos išrūgos naudojamos kaip priedas jūrų kiaulytė.

Reakcijos mechanizmas

RSK vykdoma dviem etapais: 1 fazė – mišinio, kuriame yra trys komponentai antigenas + antikūnas + komplementas, inkubavimas; 2 fazė (indikatorius) - laisvo komplemento aptikimas mišinyje, pridedant prie jo hemolizinę sistemą, susidedančią iš avių eritrocitų ir hemolizinio serumo, kuriame yra antikūnų prieš juos. 1-oje reakcijos fazėje, kai susidaro antigeno-antikūno kompleksas, jungiasi komplementas, o vėliau 2-oje fazėje antikūnais įjautrintų eritrocitų hemolizė nevyks; reakcija teigiama. Jei antigenas ir antikūnas nesutampa (tiriamame mėginyje nėra antigeno ar antikūno), komplementas lieka laisvas ir 2-oje fazėje susijungs su eritrocitų – antieritrocitų antikūnų kompleksu, sukeldamas hemolizę; reakcija neigiama.

Taikymas

Komplemento fiksavimo reakcija gali būti naudojama:
1) specifinių antikūnų identifikavimas nežinomame serume, remiantis jų sąveika su žinomo pobūdžio antigenu;
2) tiriant antigeno savybes reaguojant su žinomu specifiniu serumu. Ingredientų paruošimas RSC sustojimui.

1. Tyrimams gautas kraujo serumas reakcijos išvakarėse kaitinamas vandens vonioje 56°C temperatūroje 30 minučių, kad būtų inaktyvuotas jo paties komplementas. Inaktyvuotas serumas gali būti laikomas 3-4°C temperatūroje 5-6 dienas. Eksperimento dieną serumas skiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu santykiu 1:5 (0,1 ml tiriamojo serumo + 0,4 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo).

2. Antigenu CSC gamybai gali būti įvairių mikrobų kultūros, bakterijų baltymai ir ekstraktai, gauti iš mikrobų kultūrų, patologiškai pakitusių ir normalių organų bei audinių. Antigeno paruošimo ypatybes lemia prigimtis infekcinis procesas ir jo patogeno savybes.

3. Komplementas yra serumų mišinys, gautas iš 3-5 sveikų jūrų kiaulyčių, arba sausas komplementas ampulėse.

Prieš pat naudojimą jūrų kiaulytės serumas praskiedžiamas izotoniniu natrio chlorido tirpalu santykiu 1:10, kad būtų gautas pradinis tirpalas.

4. Prieš atliekant eksperimentą hemolizinis serumas inaktyvuojamas kaitinant 56 °C temperatūroje 30 min. Norint atlikti pagrindinį RSC eksperimentą, taip pat titruoti komplementą ir antigeną, hemolizinis serumas naudojamas trigubu titru. Pavyzdžiui, jei hemolizinio serumo titras yra 1:1800, reakcijoje naudojamas serumo praskiedimas 1:600.

5. Eritrocitai gaunami iš defibrinuoto avies kraujo. Norint pašalinti fibrino plėveles, kraujas filtruojamas per trijų sluoksnių marlės filtrą. Gautas filtratas centrifuguojamas, serumas nusiurbiamas ir nusausinamas, o eritrocitai nuplaunami 3-4 kartus centrifuguojant izotoniniu natrio chlorido tirpalu. Kai raudonieji kraujo kūneliai plaunami paskutinį kartą, ant viršaus esantis skysčio sluoksnis turi būti visiškai skaidrus. 3% suspensija ruošiama iš išplautų raudonųjų kraujo kūnelių izotoniniame natrio chlorido tirpale. Pirmiau nurodytu būdu paruošę RSC sudedamąsias dalis, titruokite hemolizinį serumą, komplementą ir antigeną.



Hemolizės reakcija.

Hemolizės reakcija (HR) – Tai raudonųjų kraujo kūnelių naikinimas veikiant antikūnams, dalyvaujant komplementui.

RG komponentai.

1. Antigenas- 3% raudonųjų kraujo kūnelių suspensija izotoniniame natrio chlorido tirpale;

2. Antikūnas - hemolizinis serumas- serumo sudėtyje antikūnai prieš raudonuosius kraujo kūnelius (hemolizinai); serumas gaunamas imunizuojant triušius avies eritrocitais;

3. Papildyti– kraujo baltymų sistema, kuri adsorbuojasi ant antigeno-antikūno komplekso ir sudaro membranos atakos kompleksą, naikinantį antigeną, t.y. naikina raudonuosius kraujo kūnelius arba, kitaip tariant, sukelia raudonųjų kraujo kūnelių lizę ( hemolizė). Šviežiai paruoštas Jūrų kiaulytės kraujo serumas.

Jei raudonieji kraujo kūneliai, hemolizinis serumas ir komplementas dedami į mėgintuvėlį tam tikrais kiekiais, po kelių minučių įvyks raudonųjų kraujo kūnelių sunaikinimas (hemolizė), dėl kurio mišinys nuo tamsiai raudonos spalvos pasidarys rausvas. („lako kraujas“).

Hemolizės reakcija naudojama kaip indikatorius atliekant komplemento fiksavimo reakciją.

Komplemento fiksavimo reakcija (CFR) yra sudėtinga serologinė reakcija, apimanti 2 antigeno antikūnus ir komplemento sistemas. 1 sistema - specifinis, 2 - hemolizinis sistema.

Šią reakciją sukūrė J. Bordet ir O. Zhangou, kurie nustatė, kad formuojantis antigeno-antikūno kompleksui prie šio komplekso jungiasi komplementas. Matomas efektas kurioje nematomas, todėl aptikti komplemento jungimąsi (ir, atitinkamai, nustatyti antigeno-antikūno komplekso susidarymą, kai jie atitinka vienas kitą), t.y. kaip indikatorius Naudojamas antrasis metodas – hemolizinė sistema.

RSC dažniau naudojamas serodiagnostikai (antikūnų prieš patogeną nustatymui paciento kraujo serume ) gonorėja, sifilis, kokliušas, šiltinė ir kitos riketsiozės bei daugelis virusinių ligų. RSC taip pat naudojamas seridentifikacijai.

RSK komponentai.

1. Antigenas– mikrobų ekstraktai, haptenai, rečiau – mikrobų suspensija, t.y. antigenas gali būti korpuskulinis (netirpus) arba molekulinis (tirpus).

2 . Antikūnas– sergančiojo kraujo serumas (serodiagnostikai) arba imuninės diagnostikos serumas, kuriame yra žinomų antikūnų (seroidentifikacijai).

3. Avių raudonieji kraujo kūneliai – antigenai hemolizinė reakcija.

4. Hemolizinis serumas- serumo sudėtyje antikūnų avių eritrocitams. Serumas gauti imunizuojant triušį avies eritrocitais.

5. Papildyti– šviežiai paruoštas jūrų kiaulytės kraujo serumas (skystas arba liofilizuotas).

6. Elektrolitas– izotoninis natrio chlorido tirpalas.

Režisavo RSK.

Prieš eksperimentą titruojamas antigenas, paciento serumas, hemolizinis serumas ir komplementas (nustatomas jų titras). Paciento serumas 30 minučių kaitinamas 56°C temperatūroje.

RSK vykdoma m 2 fazės.

I etapas - specifinis: viename mėgintuvėlyje paruošiama specifinė sistema - sumaišomi vienodi kiekiai žinomo antigeno, paciento serumo ir komplemento, kitame mėgintuvėlyje ruošiama hemolizinė sistema - avies eritrocitų ir hemolizinio serumo mišinys, mėgintuvėliai dedami į termostatas 37°C temperatūroje 30 minučių. Tuo pačiu metu paruošiami kontroliniai mėginiai antigenui, komplementui ir hemosistemai, kontroliniai mėginiai su žinomo sergančio žmogaus serumu (teigiamas serumas) ir žinomo sveiko žmogaus serumu (neigiamas serumas), taip pat 30 minučių įdedami į termostatą.

II fazė – indikatorius: į pradinį mišinį ir į visus kontrolinius mėgintuvėlius įpilami vienodi kiekiai hemolizinės sistemos ir 30 minučių palaikius termostate atsižvelgiama į reakcijos rezultatus.

DSC rezultatų apskaita buvo atlikta su puikiais rezultatais valdikliuose .

Teigiama reakcija(žmogus serga ir jo serume yra atitinkamų antikūnų prieš ligos sukėlėją – antigeną): I fazėje specifinėje sistemoje susidaro antigeno-antikūnų kompleksai, su kuriais jungiasi komplementas, pridėjus hemolizinę sistemą, in II fazė, hemolizė nepastebėta, nes komplementas yra prijungtas prie 1-osios specifinės sistemos. Matomas efektas- išsilavinimas eritrocitų nuosėdos.

Neigiama reakcija(žmogus sveikas ir jo serume nėra antikūnų prieš sukėlėją): nesusidaro antigeno-antikūno kompleksai ir I fazėje komplementas lieka laisvas, pridėjus hemolizinę sistemą II fazėje, komplementas jungiasi su antigenu-antikūnu kompleksai, kurie čia būtinai yra (tai yra eritrocitų-antikūnų kompleksai) anti-eritrocitų antikūnai) ir sukelia raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę. Matomas efektas- raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė; "lako kraujas"

Jie taip pat naudojami infekcinių ligų diagnostikai. toksino neutralizacijos reakcija (RN) su antitoksiniu serumu, imunofluorescencinė reakcija (RIF), radioimunoanalizė (RIA), su fermentu susijusi imunosorbentinė analizė (ELISA).

IN Reakcija pagrįsta dviem reiškiniais – bakteriolize ir hemolize. Komplementas dalyvauja jų pasireiškime. Todėl RSC naudojamos dvi komponentų sistemos: 1) suteikia bakteriolizės fenomeną ir yra naudojamas diagnostikos tikslais; 2) hemolizinis, indikatorinis, pagalbinis; leidžia nustatyti, ar komplementas yra susietas, ar nesusietas pirmojoje sistemoje (žr. spalvų diagramą, I pav.). Anksčiau kaip antigenas buvo naudojama bakterijų suspensija, todėl pirmoji sistema buvo vadinama bakteriolitine (teigiamais atvejais įvyko bakterijų lizė).

RSC steigimas atliekamas dviem etapais. Pirmajame etape paruošiama bakteriolitinė sistema: mėgintuvėliuose sumaišoma 0,5 ml tiriamojo serumo su antigenu, pridedamas komplementas griežtai nustatyta doze (titras). Antigeno-serumo-komplemento mišinys (bakteriolitinė sistema) laikomas vandens vonioje (arba termostate) 20...40 minučių 37...38 "C. Komponentų sąveikos mėgintuvėlyje rezultatas yra nematomas, skystis lieka skaidrus ir bespalvis Norint nustatyti, kontaktinis Jei komplementas yra bakteriolitinėje sistemoje, atliekamas antrasis reakcijos etapas: į mėgintuvėlius įpilami hemolizinės sistemos komponentai – išplauti avies eritrocitai ir inaktyvuotas hemolizinis serumas. , kaip parodyta diagramoje, visi bakteriolitinės sistemos komponentai maišomi mėgintuvėlyje, dedami į vandens vonią 37...38 "C 20...40 min. Tada pridedami hemologinės sistemos komponentai, vėl viskas suplakama ir vėl dedama į vandens vonią 10...15 min.

Preliminari rezultato apskaita. Jei serumas gaunamas iš sergančio gyvūno, jame yra antikūnų, kurie susijungia su specifiniu antigenu. Komplementas jungiasi prie šio komplekso (antigenas – antikūnas) – hemolizė nevyksta, rezultatas teigiamas.

Sveiko gyvūno serume antikūnų nėra: nesusidaro antigeno-antikūno kompleksas, bakteriologinėje sistemoje nesusijungia komplementas. Pridėjus eritrocitų ir hemolizino (tai yra tarp antigeno ir antikūno), komplementas sureaguoja su šiuo kompleksu – vyksta hemolizė, rezultatas yra neigiamas (žr. spalvą II pav.).

Galutinė rezultato apskaita. Mėgintuvėliai paliekami kambario temperatūroje 15...20 valandų Jei bakteriolitinėje sistemoje esantis serumas buvo iš sergančio gyvūno, mėgintuvėlyje susidaro specifinis antigeno-antikūnų kompleksas, kuris adsorbuoja (suriša) visą pridėtą. papildyti. Vadinasi, antroje, hemolizinėje sistemoje, hemolizė nevyksta, raudonieji kraujo kūneliai nusėda ant mėgintuvėlio dugno, o ant viršaus esantis skystis bus skaidrus. RSC rezultatas yra teigiamas.

Jei tiriamajame serume nėra specifinių antikūnų prieš naudojamą antigeną (tai atvejais, kai serumas yra iš sveiko gyvūno), antigeno-antikūno kompleksas nesusidaro bakteriolitinėje sistemoje, todėl komplementas šioje sistemoje nėra adsorbuojamas, bet lieka laisva. Pridedant hemolizinės sistemos komponentus (antroje reakcijos fazėje), komplementas sąveikauja su antruoju kompleksu (hemolizinas - raudonieji kraujo kūneliai), vyksta raudonųjų kraujo kūnelių hemolizė - nesusidaro nuosėdos, mėgintuvėlyje esantis skystis lakas-raudona spalva. RSC rezultatas yra neigiamas.

RSK. naudojami: 1) specifiniams antikūnams nustatyti sergančio gyvūno serume (bruceliozės, peripneumonijos, liaukų, leptospirozės, tripanosomozės ir kt. diagnostikai); 2) nustatyti specifinį antigeną (bakterinį ar virusinį) tiriamojoje medžiagoje, esant specifiniam imuniniam serumui.

RSC atlikti būtina turėti: tyrimams gautus serumo mėginius; du serumai, žinomi kaip teigiami (standartinis, suteikiantis teigiamą rezultatą), ir du normalūs serumai. Visi serumai, atskiesti santykiu 1:10, inaktyvuojami 56...58 °C temperatūroje 30 minučių; antigenas, praskiestas pagal titrą; komplementas, praskiestas pagal nustatytą titrą titruojant bakteriolitinėje sistemoje; hemolizino darbinis titras; avies raudonųjų kraujo kūnelių (I: 40); druskos tirpalas, graduotos pipetės, mėgintuvėliai, stovai, 37...38 °C vandens vonia.

Prieš atliekant RSC, avies kraujas defibrinuojamas ir raudonieji kraujo kūneliai nuplaunami druskos tirpalas centrifuguojant, kol supernatantas tampa visiškai skaidrus, kuris pašalinamas nusiurbiant, o nusodinti raudonieji kraujo kūneliai praskiedžiami fiziologiniu tirpalu santykiu 1:40 (2,5%). Antigenas skiedžiamas pagal etiketėje nurodytą titrą biofabriko. Hemolizinas ir komplementas titruojami prieš dedant RSC.

RSC antigenas ruošiamas biofabrikuose. Paprastai tai yra sunaikintų mikrobų suspensijų (arba virusų turinčių audinių) ekstraktai. Antigenai neturi turėti hemolizuojančio poveikio, kuris kontroliuojamas reakcijos proceso metu (į mėgintuvėlį supilama 1...2 antigeno dozės ir 0,5 ml raudonųjų kraujo kūnelių suspensijos: hemolizės neturi būti). Ant ampulės su antigenu biofabrikas rodo, kad jis skirtas RSC (sapnaya, bruceliozė ar kt.). Pakuotės dėžutėje nurodomas partijos numeris, pagaminimo data, galiojimo laikas, antigeno aktyvumas, tai yra, kokiu skiedimu jis turi būti naudojamas atliekant RSC (1:100, 1:150 ir kt.). Sergant kai kuriomis ligomis, kitos medžiagos tarnauja kaip antigenai; pavyzdžiui, diagnozuojant didelių galvijai CSC antigenas yra veršelio, eksperimentiškai užkrėsto po oda arba intrapleuraliniu būdu, limfa. Ilgai laikant antigenus, jų titras dar kartą tikrinamas laboratorijoje, naudojant specialią titravimo schemą.

Tyrimui gauti tiriamieji serumai skiedžiami fiziologiniu tirpalu santykiu 1:5 arba 1:10, inaktyvuojami kaitinant vandens vonioje, kad 30 minučių 56...58 °C temperatūroje sunaikintų savo komplementą (asilų, mulų, arklėnų serumai - 61 °C temperatūroje).

Hemolizinas gaminamas biofabrikuose hiperimunizuojant triušius nuplautais avių raudonaisiais kraujo kūneliais. Tam triušiams 4...5 kartus 2...3 dienų intervalais į veną suleidžiama 40...50% raudonųjų kraujo kūnelių suspensija. Praėjus savaitei po paskutinės injekcijos, iš triušių paimamas kraujas, serumas steriliai išsiurbiamas, inaktyvuojamas, konservuojamas gliceroliu 1:1 arba 0,5 % fenoliu, titruojamas ir supilamas į ampules. Laboratorijose prieš suskirstymą RSC vėl titruojamas.

Hemolizino titravimo schema. Būtina paruošti: i) komplemento praskiedimą santykiu 1:20; 2) hemolizinas 1:100 (0,2 ml hemolizino + 9,8 ml fiziologinio tirpalo); 3) avies eritrocitų suspensija 1:40; 4) fiziologinis NaCl tirpalas.

Norint nustatyti titravimo reakciją, dvi eilės mėgintuvėlių dedamos į stovą – viena pagalbinė skirta tik hemolizino skiedimams ruošti, antra – pačiam titravimui. Į kiekvienos eilės pirmąjį mėgintuvėlį įpilamas pradinis hemolizino praskiedimas santykiu 1:100, o po to atliekami serijiniai skiedimai. Visi mėgintuvėliai suplakami ir dedami į 37...38°C vandens vonią 10...15 minučių. Rezultato apskaičiavimas: šiame pavyzdyje mažiausias kiekis (arba didžiausias jo praskiedimas), dėl kurio įvyko visiška hemolizė, yra 1:2000, t. y. toks yra jo tikrasis titras. Darbinis titras 2 kartus labiau koncentruotas – 1:1000.

0,5 ml (pažymėta rodyklėmis) kiekvieno praskiedimo iš pirmosios eilės mėgintuvėlių perpilama į atskirus antrosios eilės mėgintuvėlius. Į visus antros eilės mėgintuvėlius įpilkite 0,5 ml komplemento (1:20), 0,5 ml avių raudonųjų kraujo kūnelių (2,5 % suspensijos arba 1:40) ir 1 ml fiziologinio tirpalo, kad skysčio tūris kiekvienas mėgintuvėlis buvo 2,5 ml.

Pastaba. Atsižvelgiant į tai, kad galutinėje RSC formulėje bus 5 komponentai po 0,5 ml, kurių tūris bus 2,5 ml, šis tūris išlaikomas viso darbo metu.

Mėgintuvėliai suplakami ir dedami į vandens vonią 10...15 min. Hemolizė pirmiausia įvyks mėgintuvėliuose, kuriuose yra daug hemolizino (jo mažiausias praskiedimas yra 1:500, 1:1000...). Mažiausias hemolizino kiekis (jo didžiausias praskiedimas), kuris tam tikromis sąlygomis sukėlė visišką raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę, vadinamas ribinis (faktinis) titras hemolizinas. Tolimesniam darbui hemolizinas naudojamas 2 kartus labiau koncentruotas, tai yra dvigubai didesnis titras, kuris vadinamas darbinis pavadinimas. Pavyzdžiui, jei tikrasis titras yra I: 2500 (arba 1: 2000), tada darbinis titras atitinka praskiedimą 1:1250 (arba 1: W00).

KOMPLEMENTAS yra komponentasšviežias serumas, limfa, audinių skysčiai skirtingi tipai gyvūnai (ir žmonės); atrado Buchneris (1889). Vabzdžiams komplemento nėra. Komplementas yra sudėtingos struktūros baltyminė medžiaga, kuri greitai inaktyvuojama kaitinant, ilgai laikant, veikiant ultravioletiniams spinduliams, stipriai kratant, filtruojant per keraminius filtrus, pridedant kaolino, rūgščių, šarmų, alkoholio, acetono, chloroformo, distiliuojant. vanduo, suspenduotos bakterijos ir kt. Komplementą galima išsaugoti į 100 ml jūrų kiaulytės serumo įpylus 5 g natrio sulfato, 4 g boro rūgštis. Komplemento veikla išlieka iki šešių mėnesių. Geriausias būdas konservavimas – džiovinimas vakuume žemoje temperatūroje (liofilizavimas). Tokios būklės uždarytose ampulėse jis galioja dvejus metus. Prieš kiekvieną RSC procedūrą komplemento aktyvumas tikrinamas titruojant, tai yra nustatomas jo titras – optimalus kiekis, reikalingas konkrečiai reakcijai. Komplementas titruojamas du kartus: hemolizinėse ir bakteriolitinėse sistemose.

Dėl komplemento titravimas hemolizinėje sistemoje paruoškite komponentus: komplementą praskiedus santykiu 1:20 (1 ml komplemento + 19 ml fiziologinio tirpalo); hemolizinas, praskiestas pagal darbinį titrą; nuplautų avių eritrocitų suspensija (1:40), fiziologinis tirpalas. Mėgintuvėliai dedami į stovą ir į juos graduota pipete po 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: iki 0,43 ml) pilamas skirtingas komplemento kiekis. Tada sudėkite likusius komponentus (57 pav.). Visi mėgintuvėliai suplakami ir dedami į 37...38 °C vandens vonią 10...15 min., o rezultatas užrašomas.

Rezultato apskaičiavimas: komplemento titru imamas mažiausias komplemento kiekis, užtikrinantis visišką hemolizę (šiame pavyzdyje – 0,25 ml).

Į titravimo rezultatą pradedama atsižvelgti mėgintuvėliuose su didžiausia didelis kiekis komplementas, kur pirmiausia tikimasi hemolizės. Mažiausias komplemento kiekis, kuris tam tikromis sąlygomis užtikrina visišką raudonųjų kraujo kūnelių hemolizę, vadinamas komplemento titras hemolizinėje sistemoje.

Dėl komplemento titravimas bakteriolitinėje sistemoje būtina, kad darbiniame titre būtų visi reakcijos komponentai: komplementas (1:20), raudonieji kraujo kūneliai (1:40), hemolizinas, du teigiami ir du normalūs serumai, specifinis antigenas. Serumai skiedžiami fiziologiniu tirpalu santykiu 1:10, inaktyvuojami 30 minučių 56...58 X. Kiekvienas serumas pilamas į dvi eiles po 0,5 ml tūbeles. Į kiekvienos eilės mėgintuvėlius pridedamas komplementas didėjančiais kiekiais, kaip ir titruojant hemolizinėje sistemoje; pradėkite nuo kiekio, paimto titrui hemolizinėje sistemoje, tada kiekviename paskesniame mėgintuvėlyje dozė didinama 0,03 ml, tūrį išlyginant iki 0,5 ml fiziologiniu tirpalu.

Po to į vieną mėgintuvėlių eilę su teigiamais ir normaliais serumais įpilama 0,5 ml antigeno, o į antrą kiekvieno serumo eilę – po 0,5 ml fiziologinio tirpalo. Visi mėgintuvėliai suplakami ir įdedami į vandens vonią 30...40 minučių. Tada į visus mėgintuvėlius įpilama 0,5 ml hemolizino ir 0,5 ml eritrocitų, suplakama ir vėl statoma į vandens vonią 10...15 min. Mažiausias komplemento kiekis, užtikrinęs visišką raudonųjų kraujo kūnelių lizę abiejose mėgintuvėliukų eilėse (su antigenu ir be antigeno) iš dviejų normalių serumų, vienoje kiekvieno teigiamo serumo eilėje (be antigeno) ir visiškai uždelsus (nesant) hemolizė teigiamų serumų su antigenu eilėse (tomis pačiomis komplemento dozėmis), vadinama komplemento titras, kuri naudojama nustatant pagrindinę RSC patirtį atliekant diagnostinius tyrimus.

Pagrindinė RSK patirtis (iš tikrųjų diagnostinis testas). Dvi mėgintuvėlių eilės dedamos į stovus pagal tiriamų serumo mėginių skaičių. Į du mėgintuvėlius supilama po 0,5 ml kiekvieno inaktyvuoto serumo: į vieną įpilama antigeno - 0,5 ml, į kitą (be antigeno) - 0,5 ml fiziologinio tirpalo ir, pridedant komplemento, sukuriama bakteriolitinė sistema, o po to hemolizinė. pridėta.

Būtini komponentai: 1) tiriamasis serumas, inaktyvuotas, praskiestas fiziologiniu tirpalu santykiu 1:10; 2) specifinis antigenas, praskiestas pagal biofabriko nurodytą titrą pakuotės etiketėje; 3) komplementas nustatytame titre; 4) hemolizinas darbiniame titre; 5) išplautos avies eritrocitų suspensija 1:40; 6) fiziologinis NaCl tirpalas. Tiriamasis serumas pilamas į dvi eiles mėgintuvėlių. Bet kokiam tiriamųjų serumų skaičiui kaip kontrolė naudojamas žinomas teigiamas serumas (duodantis teigiamą rezultatą) ir normalus (iš sveiko gyvūno, duodantis neigiamą rezultatą).

Mėgintuvėliai su bakteriolitinės sistemos komponentais suplakami ir dedami į vandens vonią 20...40 minučių 37...38°C temperatūroje. Antros eilės bakteriolitinės sistemos be antigeno mėgintuvėliai suplakami ir tomis pačiomis sąlygomis dedami į vandens vonią.

Tada hemolizinės sistemos komponentai dedami į visus pirmos ir antros eilės mėgintuvėlius ir antrą kartą dedami į vandens vonią 10...15 min. Visuose antrosios eilės mėgintuvėliuose be antigeno vyksta visiška hemolizė.

Prieš gaunant galutinį rezultatą, mėgintuvėliai paliekami kambario temperatūroje 18...24 val. Visuose mėgintuvėliuose be antigeno, neatsižvelgiant į tai, ar serumas buvo gautas iš sergančio ar sveiko gyvūno, pirmame turi įvykti hemolizė eilės mėgintuvėlius su antigenu, aiškesnis rezultatas išreiškiamas stovint .

Reakcijos rodmenys mėgintuvėliuose su tyrimo serumu laikomi patikimais, jei nėra hemolizės mėgintuvėliuose su teigiamu serumu ir antigenu, visiškai hemolizės mėgintuvėliuose su teigiamu serumu be antigeno ir visuose mėgintuvėliuose su akivaizdžiai normaliu serumu (61 pav.). ).

Šią reakciją turi lydėti antigeno, komplemento, hemolizino ir eritrocitų kontrolė. Norėdami tai padaryti, antigenas su avių raudonaisiais kraujo kūneliais pilamas į atskirus mėgintuvėlius; papildyti raudonaisiais kraujo kūneliais be hemolizino; hemolizinas su raudonaisiais kraujo kūneliais be komplemento; raudonieji kraujo kūneliai ir druskos tirpalas. Tūris kiekviename mėgintuvėlyje sureguliuojamas iki 2,5 ml fiziologiniu tirpalu. Mėgintuvėliai suplakami ir 20 minučių dedami į 37 °C vandens vonią. Visuose kontroliniuose mėgintuvėliuose neturėtų būti hemolizės.

RSK rezultatasĮprasta tai išreikšti „kryžiais“. Teigiamo reakcijos rezultato rodikliai: + + + + (///) - visiškas raudonųjų kraujo kūnelių nusėdimas (ne hemolizės), skystis virš nuosėdų yra bespalvis, + + + (///) - virš nuosėdų esantis skystis vos pastebimai gelsvas. Abejotinas reakcijos rezultatas: dugne nusėdusių eritrocitų buvimas ir dalinis supernatanto dažymas dėl kai kurių eritrocitų lizės žymimas + + - (++), tai yra, du ir du su puse kryžių. . Sunki hemolizė (be nuosėdų) arba su mažomis nuosėdomis (+) yra neigiamas rezultatas.

Ilgalaikė komplemento fiksavimo reakcija (LDCR). Veiksmingesnis jautrumui, priešingai nei įprastas klasikinis RSK. Reakcijos esmė yra ta, kad bakteriolitinė sistema palaikoma trimis skirtingomis temperatūros sąlygos: sumaišius komponentus kambario temperatūroje 15 min., po to žemoje temperatūroje (4 °C) šaldytuve 18...20 val. ir vandens vonioje 15 min. Po to pridedama hemolizinė sistema, sukratoma, vėl dedama į vandens vonią ir registruojama reakcija, kaip ir naudojant RSC. RDSC veiksmingumas patvirtintas diagnozuojant daugybę infekcinių ligų (tuberkuliozės, vibriozės, bruceliozės ir kt.).

Komplemento fiksavimo slopinimo reakcija (CPF) arba slopinimo reakcija, netiesioginė FCC.Šioje reakcijoje dalyvauja ir kitas komponentas – standartinis imuninis serumas, turintis antikūnų prieš antigeną, paprastai naudojamą diagnozei, todėl teigiamai reaguoja į klasikinį CSC.

Tiriamasis serumas sumaišomas su antigenu ir kurį laiką paliekamas be komplemento. Tada pridedama komplemento ir standartinio serumo, mėgintuvėliai suplakami ir dedami į vandens vonią 20...30 minučių, po to įpilama hemolizinė sistema ir vėl dedama į vandens vonią. Jei hemolizės nėra, rezultatas yra neigiamas, nes tiriamasis serumas nereagavo su antigenu, o pastarasis sureagavo su standartinis serumas, privalomas papildymas. Jei tiriamasis serumas yra iš sergančio gyvūno, jame yra specifinių antikūnų, susijusių su antigenu, t. y., vyksta reakcija tarp antigeno ir antikūnų, nefiksuojant komplemento. Antigenas, sąveikaudamas su tiriamojo serumo antikūnais, nereaguoja (supresuojamas) su standartiniu (žinoma specifiniu) serumu, komplementas lieka laisvas ir reaguoja hemolizinėje sistemoje – vyksta hemolizė, reakcijos rezultatas yra teigiamas. į tiriamąjį serumą.

Metodas fluorescenciniai antikūnai (MFA).Šio metodo galimybes lemia pirmosios serologinių reakcijų fazės specifiškumas su dideliu liuminescencinės analizės jautrumu. Norint atlikti MFA, būtina turėti labai specifinį imuninį liuminescencinį serumą. Yra žinoma, kad įvairiose serologinėse reakcijose, naudojamose mikrobiologinėje praktikoje, daugiausia dalyvauja trys komponentai: bakterinis antigenas, antikūnas ir komplementas. Tiesą sakant, visi trys komponentai yra antigenai, ir prieš kiekvieną iš jų galima gauti imuninius serumus ir atitinkamai liuminescencinius antikūnus. Priklausomai nuo to, kokio tipo fluorescencinis serumas naudojamas (prieš bakterinį antigeną, antibakterinius antikūnus, komplementą), yra trys pagrindiniai fluorescuojančių antikūnų metodo variantai: tiesioginis (1) ir netiesioginis (2) variantas ir netiesioginio varianto modifikavimas naudojant komplementą. Šių modifikacijų imunologinė reakcija tarp antigeno ir antikūno atliekama tiesiai ant stiklelio. Mikroorganizmams fiksuoti naudojami organiniai tirpikliai: acetonas, etanolis, metanolis, dioksanas, taip pat įprasti mikrobiologinėje praktikoje naudojami fiksatoriai: formalinas, Nikiforovo mišinys, Carnoy skystis ir kt.

Tiesioginis variantas. Ant gatavo preparato tepamas specifinis liuminescencinis serumas tam tikras laikas, tada serumo perteklius nupilamas, preparatas nuplaunamas ir apžiūrimas fluorescenciniu mikroskopu. Šis metodas taikomas bakterijoms aptikti patologinėje medžiagoje, objektuose išorinė aplinka, taip pat patogenams pasėliuose nustatyti.

Netiesioginis (dviejų pakopų) variantas. Pirmajame etape susidaro specifinis antigeno derinys su atitinkamu nepažymėto serumo antikūnu. Antrajame etape specifinis nepažymėtas antikūnas prisijungia prie anti-rūšinio liuminescencinio antikūno, esančio gyvūno, imunizuoto globulinais (arba viso kraujo serumu), tos rūšies, iš kurios buvo naudojamas imuninis serumas, serume.

Netiesioginis antikomplementarus (trijų pakopų) variantas. Pirmasis etapas: antigenu nepažymėto antikūnų komplekso susidarymas. Antrasis etapas: normalaus serumo, kuriame yra komplemento, sluoksniavimas. Trečias etapas: antigeno-antikūno-komplemento kompleksas yra apdorojamas liuminescenciniu antikomplementaru serumu, paruoštu imunizuojant triušius su gyvūnų rūšies serumu, kuris buvo komplemento šaltinis.

Netiesioginiai MFA variantai gali būti naudojami tiek antigenams, tiek antikūnams nustatyti. Be to, norint nustatyti dviejų pakopų parinktį, reikia turėti ribotą antirūšinių liuminescencinių serumų rinkinį (nuo galvijų, avinų, arklių, kiaulių ir kt. globulinų), o anti-papildomam variantui tai yra pakanka turėti tik vieną liuminescencinį serumą nuo jūrų kiaulytės globulinų.

Imunoliuminescencijos ir mikroskopijos metodai. Veterinarinių bakteriologinių laboratorijų praktikoje naudojami biofabrikuoti liuminescenciniai serumai. Priklausomai nuo fluorochromo tipo, liuminescenciniai serumai suteikia objektui arba žalią švytėjimą (fluorescenciniai dažai), arba raudoną švytėjimą (rodamino pagrindu pagaminti dažai).

Norint atlikti imunoliuminescencinę mikroskopiją, tiriamą medžiagą reikia uždėti ant neriebalų, plonų, nesubraižytų stiklelių. Tiriant gyvūnų organus ir audinius pirštų atspaudų preparatai ruošiami plonu sluoksniu. Preparatai džiovinami ore ir dedami į fiksuojantį skystį (etanolis - 15 min., metanolis - 5 min., acetonas - 5 min.). Jei reikia, po fiksavimo preparatus kurį laiką galima laikyti šaldytuve. Seka ir tolesnės procedūros priklauso nuo naudojamos MFA versijos (vieno etapo, dviejų etapų, trijų pakopų). Preparatų apdorojimas liuminescenciniais serumais, taip pat nepažymėtais pirmos pakopos serumais ir komplementu, atliekamas 37°C temperatūroje drėgnoje kameroje (Petri lėkštelės su sudrėkintu filtravimo popieriumi).

Vieno etapo variantas. Liuminescencinis serumas užtepamas ant stiklelio su fiksuota tiriamąja medžiaga (ant ampulės nurodytu skiedimu). Vaistas dedamas į drėgną kamerą 15...20 minučių 37 °C temperatūroje. Tada inde plaunamas buferiniu fiziologiniu tirpalu (pH 7,4), po 5...10 minučių tirpalą keičiant kelis kartus, arba po tekančiu vandeniu 3...5 minutes. Vanduo turi būti neutralus ir be geležies. Uždedamas buferinis glicerinas, kurio pH yra 8,0 ir uždengiamas dengiamuoju stiklu. Ant dengiamojo stiklelio uždedamas nefluorescencinis panardinamasis skystis ir tiriamas mikroskopu.

Dviejų etapų variantas. Lašas pirmos stadijos nepaženklinto imuninio serumo užlašinamas ant stiklelio su tiriamąja medžiaga. Vaistas dedamas į termostatą drėgnoje kameroje 15...20 minučių. Tada jis nuplaunamas, kaip aprašyta aukščiau, išdžiovinamas ir užlašinamas lašelis liuminescencinio anti-rūšinio serumo. Vaistas vėl dedamas į termostatą drėgnoje kameroje 15...20 minučių. Pakartokite plovimo procedūrą ir išdžiovinkite filtravimo popieriumi. Užtepamas buferinis glicerolis, uždengiamas dengiamuoju stikleliu, užtepamas nefluorescencinis imersinis skystis ir tiriamas mikroskopu.

Trijų pakopų parinktis (nepapildoma). Lašas pirmos stadijos nepaženklinto imuninio serumo užlašinamas ant stiklelio su tiriamąja medžiaga. Vaistas dedamas į termostatą, kaip aprašyta aukščiau, išdžiovinamas ir ant tepinėlio užlašinamas lašelis komplemento. Vaistas vėl dedamas į drėgną kamerą ir termostatą 15...20 min., po to nuplaunamas ir užtepamas liuminescencinis antikomplementarinis serumas. Tolesnės procedūros yra panašios į vieno etapo parinktį.

Kontrolinių preparatų ruošimas ir apdorojimas. 1. Tiesioginio pasirinkimo atveju, siekiant nustatyti reakcijos tarp antigeno ir liuminescencinio serumo specifiškumą, heterologinių mikrobų rūšių tepinėlių preparatai turi būti apdoroti tuo pačiu serumu. Šios rūšys turi būti antigeniškai panašios, tačiau morfologija skirtis nuo tiriamų mikroorganizmų; antigeniškai nutolę nuo tiriamų mikroorganizmų, tačiau savo morfologija ir pasiskirstymu panašios į juos. Imprint preparatai apdorojami liuminescenciniu normaliu serumu.

2. Taikant netiesioginį variantą, būtina turėti tris kontrolinius preparatus, apdorotus normaliu serumu, liuminescenciniu anti-rūšiniu serumu be imuniniu nepažymėtu serumu ir liuminescenciniu priešrūšiniu serumu su žinomu pirmos stadijos imuniniu serumu.

3. Dėl netiesioginio varianto su papildymu reikalingi kontroliniai preparatai, kurių gydymo metu imuninis serumas pakeičiamas normaliu tos pačios rūšies ir tų pačių skiedimų serumu, taip pat preparatai, apdoroti visomis sudedamosiomis dalimis, išskyrus imuninį serumą.

Rezultatų įvertinimas. Atsižvelgiama į švytėjimo ryškumą, spalvą, lokalizaciją ir struktūrą. Bakterijos, nudažytos liuminescenciniu serumu, paženklintu fluoresceino izotiocianatu, periferijoje ryškiai žaliai šviečia apvado arba aureolės pavidalu, centrinė dalis šviečia silpnai. Šis švytėjimas vadinamas specifiniu, priešingai nei nespecifinis, kai visas ląstelės kūnas šviečia tolygiai. Kuo ryškesnė bakterijų ląstelė yra preparate, tuo aštresnis kraštas. Šį švytėjimą galima paaiškinti tuo, kad iš vienetinio ląstelės „periferijos“ ploto į stebėtojo akies tinklainę projektuojama kelis kartus daugiau antikūnų nei iš centrinės mikrobinės ląstelės dalies. Reikėtų nepamiršti, kad plastikinės ląstelės (leptospirai, vibrionai) neturi kontūro arba jis yra silpnai pastebimas. Ląstelėse, panardintose į audinių skystį ir jaunose bacilose juodligė kontūrai dažniausiai būna neryškūs.

Liuminescencijos intensyvumas vertinamas naudojant keturių kryžių sistemą: + + + + - labai ryški fluorescencija išilgai mikrobinės ląstelės periferijos, aiškiai kontrastuojanti su tamsiu ląstelės korpusu; + + + - ryški ląstelės periferijos fluorescencija; + + - silpnas ląstelės periferijos švytėjimas; + - nėra mikrobinės ląstelės kūno periferijos kontrastinio švytėjimo. Specifinio švytėjimo nebuvimas žymimas „-“ (matomi mikroorganizmų šešėliai). Diagnozuojant įvairius patogenus teigiamas rezultatas Dažniausiai bakterijų ląstelių savitasis liuminescencija laikomas ne mažesniu kaip keturi ar trys kryželiai.