Традиционна цитогенетикакогато се изучава кариотипа, той винаги е бил ограничен до нивото на разделителна способност на лентата. Дори когато използвахме методи с висока разделителна способност за диференциално оцветяване на хромозоми, ние само откривахме повече ленти на хромозома, но не бяхме сигурни, че достигаме до молекулярното ниво на разделителна способност. Последни постиженияДНК технологията и цитогенетиката направиха възможно използването на FISH техники за анализ на промените в хромозомната ДНК на молекулярно ниво. Молекулярната цитогенетика осигури революционен пробив в цитогенетиката, позволявайки:

Анализира ДНК структурата на хромозомите в диапазона от 10-100 килобази;
диагностицират неделящи се интерфазни клетки, което има огромно влияние върху пренаталната диагностика и предимплантационната генетична диагностика (PGD).

FISH технологияизползва ДНК сонда, която свързва или свързва специфични ДНК последователности в хромозомата. Денатурираната проба се инкубира с нативната ДНК на клетката, също денатурирана до едноверижно състояние. Сондата замества биотин дезоксиуридин трифосфат или дигоксигенин уридин трифосфат с тимидин. След ренатуриране на нативната ДНК със сонда, комплексът сонда-ДНК може да бъде открит чрез добавяне на белязан с флуорохром биотин-свързващ авидин или белязан с флуорохром анти-дигоксигенин. Допълнително усилване на сигнала може да се получи чрез добавяне на антиавидин и изследване на получения комплекс с помощта на флуоресцентна микроскопия. Чрез маркиране на различни ДНК сонди с няколко различни флуорохроми е възможно едновременно да се визуализират множество хромозоми или хромозомни сегменти в една клетка като многоцветни сигнали.

Възможност за дефиниране специфични генни сегменти, налични или отсъстващи в хромозомите, направиха възможно диагностицирането на синдроми на генна последователност на ниво ДНК, както и транслокации в интерфазните ядра, често в отделни клетки.

Материал за РИБАможе да служи или метафазни хромозомиядра, получени от делящи се клетки, или интерфазни ядра от клетки, които не са в етап на делене. Срезовете се третират предварително с РНКаза и протеиназа за отстраняване на РНК, която може да кръстосано хибридизира със сондата и хроматина. След това те се нагряват във формамид за денатуриране на ДНК и се фиксират с ледено студен алкохол. След това сондата се подготвя за хибридизация чрез нагряване. След това сондата и хромозомният препарат се смесват и се затварят с покривно стъкло при 37°C за хибридизация. Чрез промяна на температурата на инкубация или състава на солта на хибридизационния разтвор, специфичността на свързване може да бъде увеличена и фоновото маркиране може да бъде намалено.

Приложение на флуоресцентна in situ хибридизация - FISH технология

Ефективност на технологията FISHе демонстриран за първи път чрез локализиране на гени към . С въвеждането на флуоресцентно маркиране, in situ хибридизацията се оказа незаменима за диагностициране на хромозомни аномалии, които не могат да бъдат открити традиционни методиленти. FISH също изигра ключова роля в едно от най-необикновените открития в света. съвременна генетика- геномен импринтинг.

Технология на неговото развитие РИБАполучени в три форми. Центромерните или алфа сателитни сонди се характеризират с относителна хромозомна специфичност и се използват най-често в генетиката на интерфазните клетки. Тези сонди генерират донякъде дифузни сигнали с подходяща сила в центромерната област, но не кръстосано хибридизират с хромозоми, имащи подобни центромерни последователности. Понастоящем са разработени сонди с едно копие, които осигуряват дискретен сигнал от специфична хромозомна лента и избягват феномена на кръстосана хибридизация. Тези сонди могат също да се използват за определяне на броя на копията и специфичните региони на хромозома, за които се подозира, че са свързани с определен синдром. Еднокопие и центромерни сонди, предназначени за хромозоми 13, 18, 21, X и Y, се използват за пренатална диагностика.

Възможно е също да се „оцветят“ цели хромозоми с помощта на РИБА. Благодарение на технологията за спектрално кариотипиране, която използва смес от различни флуорохроми, сега е възможно да се създаде уникален флуоресцентен модел за всяка отделна хромозома с 24 отделни цвята. Тази технология прави възможно откриването на сложни хромозомни пренареждания, които не се виждат с помощта на традиционните цитогенетични техники.

Метод РИБАв пренаталната диагностика. За жените в напреднала репродуктивна възраст бременността може да бъде повод не толкова за радост, колкото за безпокойство. Възрастта на жената е свързана с риска от развитие на фетални хромозомни аномалии. Амниоцентезата, извършена на 16 седмица от бременността, последвана от анализ на кариотипа отнема 10-14 дни. Използването на FISH при предварителен преглед може да ускори диагностиката и да намали времето за чакане. Повечето генетици и лаборатории са на мнение, че FISH не трябва да се използва изолирано за вземане на решения относно по-нататъшното водене на бременността. Методът FISH трябва да бъде допълнен с кариотипен анализ, като неговите резултати трябва поне да корелират с патологичната картина ултразвуково изследване(ултразвук) или биохимичен скрининг с помощта на майчина кръв.

Генни синдроми последователностиизвестни още като синдроми на микроделеция или сегментна анеузомия. Това са делеции на съседни хромозомни фрагменти, обикновено включващи много гени. Синдромите на генната последователност са описани за първи път през 1986 г. с помощта на класически цитогенетични техники. Сега, благодарение на FISH, е възможно да се идентифицират субмикроскопични делеции на ниво ДНК, което направи възможно идентифицирането на най-малката изтрита област, свързана с развитието на определен синдром, наречена критична област. След като бъде идентифицирана критичната област за даден синдром, често е възможно да се идентифицират специфични гени, чието отсъствие се разпознава като свързано със синдрома. Скорошен наръчник за синдроми на генна последователност съобщава за 18 синдрома на делеция и микроделеция, свързани с 14 хромозоми. Някои от най-често срещаните синдроми на генна последователност и техните клинични проявленияса дадени в табл. 5-2.

Теломери- образувания, покриващи краищата на дългите и късите рамена на хромозомите. Те се състоят от повтарящи се последователности TTAGGG и предотвратяват сливането на краищата на хромозомите един с друг. Теломерните сонди играят важна роля в разпознаването на сложни транслокации, които не могат да бъдат открити с традиционните цитогенетични методи. В допълнение, едно от откритията на проекта за човешкия геном е фактът, че областите на хромозомите, съседни на теломерите, са богати на гени. Сега е доказано, че субмикроскопичните субтеломерни делеции са отговорни за появата на много генетично определени заболявания.

Определяне на HER-2 туморен статус чрез FISH- изследване на предразположеността към развитие на тумори и избор на своевременно адекватно лечение на рак на гърдата (РМЖ) или рак на стомаха (РГ).

HER-2 (HER-2/neu)- човешки епидермален растежен фактор рецептор-2 е протеин, който може да повлияе на растежа ракови клетки. Създава се от специален ген, наречен HER-2/neu ген. HER-2 е рецептор за определен растежен фактор, наречен човешки епидермален растежен фактор, който се среща естествено при хората. Когато човешкият епидермален растежен фактор се прикрепи към HER-2 рецепторите на раковите клетки на гърдата, той може да стимулира тези клетки да растат и да се делят. В здрава тъкан HER-2 предава сигнали, които регулират клетъчната пролиферация и оцеляване, но свръхекспресията на HER-2 може да причини злокачествена трансформация на клетките.

Свръхекспресията на HER-2 при някои подвидове рак на гърдата води до повишена пролиферация и ангиогенеза, дисрегулация на апоптозата (генетично програмирано клетъчно самоунищожение). Доказано е, че при рак на гърдата свръхекспресията на този рецептор в туморната тъкан е свързана с по-агресивен ход на заболяването, повишен метастатичен потенциал на тумора и по-малко благоприятна прогноза. Откриването на връзката между свръхекспресията на HER-2 и неблагоприятната прогноза за рак на гърдата доведе до търсене на подходи за лечение, които са насочени към специфично блокиране на онкогена HER-2/neu (таргетна анти-HER2 терапия).

Рак на гърдата (BC) - злокачествен тумор жлезиста тъканмлечна жлеза. Ракът на гърдата е на първо място сред всички злокачествени заболявания при жените.

В зависимост от наличието на биологични маркери на тумора - експресията на хормонални рецептори (естроген и/или прогестерон), експресията на HER-2 - хормонален рецептор-положителен, HER-2-положителен и тройно негативен рак на гърдата.

HER-2/neu-позитивните (HER-2+) видове рак на гърдата се характеризират с висока експресия на HER-2/neu протеина.
HER=2/neu-отрицателни (HER-2-) видове рак на гърдата се характеризират с ниска експресия или липса на HER-2/neu протеин.
Смята се, че всяка пета жена с рак на гърдата има HER-2 положителен тумор. Повечето видове рак на гърдата са хормонално зависими: естрогените и прогестеронът имат стимулиращ ефект (пролиферативен и неопластичен) върху тях. При HER-2-позитивен рак на гърдата има излишък от HER-2 рецептори на повърхността на туморните клетки. Това явлениесе нарича „положителен HER-2 статус“ и се диагностицира при 15–20% от жените, страдащи от рак на гърдата.

НЕЯ-2- рецептор за човешкия епидермален растежен фактор тип 2, който присъства нормално в тъканите, участвайки в регулацията на клетъчното делене и диференциация. Неговият излишък върху повърхността на туморните клетки (свръхекспресия) определя бързия неконтролиран растеж на тумора, висок риск от метастази и ниска ефективност на някои видове лечение. HER-2 позитивният рак на гърдата е особено агресивна форма на това заболяване, Ето защо точно определениеСтатусът HER-2 е от ключово значение за избора на тактика на лечение.

Рак на стомаха (GC)- злокачествен тумор, произхождащ от епитела на стомашната лигавица.

GC заема 4-то място в структурата на заболеваемостта от рак и 2-ро място в структурата на смъртността от рак в света. Честотата на рак на стомаха при мъжете е 2 пъти по-висока, отколкото при жените. Русия е един от регионите с висока заболеваемост от рак на стомаха и смъртност от това заболяване. Диагностика на рак на стомаха на ранни стадиитрудно поради дългия асимптоматичен ход на заболяването. GC често се открива в късните етапи, когато 5-годишната преживяемост не надвишава 5-10%, а химиотерапията остава единственият метод на лечение.

Основният метод за лечение на рак на стомаха е операцията. Въпреки това, при повечето пациенти при диагностицирането се установява широко разпространен туморен процес, което прави радикалната операция невъзможна и изисква системно лекарствена терапия. Химиотерапията статистически значимо увеличава общата преживяемост на пациентите с метастатичен рак, подобрявайки качеството им на живот.

Онкогенът HER-2 (erbB-2) първоначално е идентифициран в тумори на гърдата. Амплификацията и свръхекспресията на този ген е относително специфично събитие за карциноми на гърдата и практически не се среща в тумори с други локализации. Ракът на стомаха изглежда е едно от малкото изключения, като активирането на HER-2 се наблюдава при приблизително 10-15% злокачествени новообразуванияна този орган и корелира с агресивния ход на заболяването.

Свръхекспресията на HER-2 е фактор за лоша прогноза. Според различни проучвания амплификацията на гена HER-2 при пациенти с рак корелира с ниски нива на обща преживяемост.

За оценка на статуса на HER-2 при рак и рак на гърдата се използва методът FISH.

РИБА- изследването ви позволява да определите качествени и количествени промени в хромозомите за диагностика на злокачествени кръвни заболявания и солидни тумори.

Днес изследванията FISH се използват широко в целия свят.

Методът FISH (флуоресцентна in situ хибридизация) е изследване на броя на гените HER-2/neu в раковите клетки.

Показания:

• рак на гърдата - с цел прогноза и избор на терапия;
• рак на стомаха - с цел прогноза и избор на терапия.

Подготовка
Определя се от лекуващия лекар.

Необходими са хистологичен протокол и имунохистохимичен протокол, IHC стъкло.

Тълкуване на резултатите
Резултатите от теста FISH се изразяват, както следва:

1. Положителен (повишено съдържание, има амплификация на гена HER-2):

• HER-2 позитивен рак на гърдата;

2. Отрицателен (без амплификация на HER-2 ген):

• HER-2 негативен рак на гърдата.

Рак на млечната жлеза - опасна болест, което според статистиката е на първо място сред раковите заболявания при жените. Рискът от развитие на това заболяване се увеличава при всички жени над 40-годишна възраст и може да се дължи на няколко други фактора. Най-вероятните причини за рак на гърдата включват затлъстяване, генетична или наследствена предразположеност, ранен стартменструация и нейното късно завършване, хормонална или лъчева терапия.

В допълнение, рискът от заболеваемост е повишен при нераждали жени и жени, които вече са имали рак. Мъжете също могат да получат рак на гърдата.

Видове и методи за диагностика

Първият етап от диагностицирането на рак на гърдата е рутинен преглед от мамолог. Жените над 40 години трябва да се подлагат на такива прегледи поне веднъж на две години. Лекарят извършва визуален преглед, палпация и мамография на млечните жлези. Визуалните признаци на развитие на заболяването могат да включват:

Главна информация

Рентгенографията на гърдата (мамография) ви позволява да определите наличието, размера и местоположението на тумора. За повишаване на точността на получените резултати се използва технологията за въвеждане на контрастно вещество. Ако вече е открит тумор, тогава се използва методът на пневмоцистография - отстраняване на туморна течност и въвеждане на въздух в кухината. Ако наличието на тумор не е уточнено, тогава се използва дуктография - въвеждане на контрастно вещество в млечните канали.

Тези методи ви позволяват да визуализирате наличието на образувания в гръдната тъкан.

Ако наличието на тумор стане очевидно и при мамография, пациентът получава направление за набор от диагностични мерки:

С помощта на ултразвук лекарят може да различи тумор от киста и да изясни местоположението на образуването. След това от него се взема тъканна проба за биопсия. Биопсията ви позволява да разберете вида на тумора: доброкачествен или злокачествен, както и да определите дали туморът е хормонално зависим. Тази информация позволява на лекаря да вземе решение за стратегия за лечение, но не винаги дава възможност да се определи етапът. Често, дори и с всички необходими диагностични дейностиможе да се определи само след операция.

Механизъм на хистологичните изследвания

Преди и след операцията се извършва тъканна биопсия. Процедурата се извършва след изясняване на локализацията на образуванието.

Биопсията е процес на отстраняване на парче тъкан и нейното изследване се нарича „хистологично изследване“ или просто „хистология“.

Медицинският работник използва специална игла за отстраняване на малко количество тъкан от тумора или тумор, който вече е бил отстранен от тялото на пациента, се изпраща за хистологично изследване. След това тъканният фрагмент е специално оцветен и обработен, за да се увеличи контрастът и да се улесни изследването. Специалистът изследва среза под микроскоп и дава мнение за качеството на туморната формация. Много в това изследване зависи от вниманието и квалификацията на лабораторния техник, който дава заключението.

Подобно изследване е имунохистохимията. Като цяло може да се нарече и „хистология“, т.к методът се основава на изследване на тъкани, но имунохистохимията е по-напреднал метод за анализ. При това изследване тъканта се оцветява и със специални реагенти, които не само засилват визуалния контраст, но и се комбинират („маркират“) с антитела по специален начин, което дава възможност да се изяснят повече характеристики на тумора. В този случай реакцията протича много по-бързо, което ви позволява бързо да получите резултатите от анализа.

Имунохистохимията позволява не само да се изясни вида на тумора, но и да се планира стратегия за лечение на пациента въз основа на идентифициране на чувствителността на туморната тъкан към различни видоветерапевтични ефекти. В допълнение, това изследване е възможно най-автоматизирано, което ни позволява да сведем до минимум вероятността от диагностична грешка поради човешкия фактор.

Има и съвременни диагностични мерки, които позволяват да се открие наличието на тумор в тялото: това е спектрален кръвен тест, имунологичен (биохимичен) анализ, FISH тест на туморна тъкан. Генетичният кръвен тест позволява на всяка жена да провери дали има или няма предпоставки за рак на гърдата. CT и MRI позволяват точно да се определи местоположението на тумора и да се наблюдава динамиката на неговото развитие, като се оценява структурата на тумора.

Как да открием рак чрез кръвен тест?

Обикновено кръвен тест се предписва от лекар след ултразвуково изследване. Има ситуации, когато пациентът собствена инициативадарява кръв за маркери на прозорци или генетичен анализ за идентифициране на предразположеност към рак на гърдата. В някои случаи общ анализкръвта може да е причина да се свържете с онкологична клиника (заедно с палпиране на бучка или визуални признаци на рак).

Биохимичен анализ

Кръвта като материал за изследване позволява извършването на следните диагностични мерки:

В същото време само първите два анализа могат да се нарекат специализирани методи за определяне на рак, вторият от които е по-скоро превантивна мярка, отколкото оперативна. Други два кръвни теста се правят предимно преди операцията, за да се установи състоянието на организма и степента на процеса. Въпреки това, както вече беше споменато, ако се усети бучка в гърдите и общият кръвен тест показва повече от два отрицателни диагностични коефициента, това е причина да се консултирате със специалист. Отрицателните коефициенти са показатели извън нормата в определени параметри на кръвния състав.

Биохимичният кръвен тест може да установи наличието на антитела срещу туморни клетки. Такива тела се наричат ​​туморни маркери. Броят и видът на туморните маркери зависи от спецификата (локализацията) раков тумори етапа на неговото развитие. Туморните маркери включват:

В случай на рак на гърдата, лекуващият лекар ще се интересува предимно от наличието на туморен маркер CA-15-3, тъй като присъствието му в кръвта ясно показва рак на гърдата. Декодирането на резултата отнема средно един ден. Биохимичен анализ се извършва няколко пъти в хода на заболяването. Кръвта за това се взема от вената през първата половина на деня на празен стомах. Две седмици преди изследването пациентът спира приема на всички лекарства(потвърждава се от лекуващия лекар). Два дни преди кръводаряване не трябва да пиете алкохол, мазни и пържени храни.

Един час преди процедурата не трябва да се пуши и е препоръчително да се намали емоционален стрес. Кръв върху биохимичен анализОбикновено те не се приемат веднага след лъче- и физиотерапевтично лечение.

Определяне на генетични фактори

Преди да говорим за генетично кръвно изследване, си струва да подчертаем разликата между понятията „генетичен“ и „наследствен“. Генетичен факторпоявата на рак е по-широко понятие, което предполага не само наличието на роднини с рак на гърдата, но и специфична генна мутация, която увеличава риска от това заболяване.

Наследствеността предполага потенциален риск от рак на гърдата въз основа на фамилната история. В същото време не само жените, но и мъжете могат да получат мутантния ген, но неговият носител не е задължително да се разболее.

Всяка жена може да се подложи на генетично изследване. Това се препоръчва особено за тези, чиито преки роднини са имали рак на гърдата. Преди да дари кръв за анализ, пациентът трябва да говори със специалист в областта на генетиката, който ще обясни нюансите на дешифрирането на резултатите. Не се изисква специална подготовка от пациента преди кръводаряване.

В случай на получаване положителен резултат BRCA генни мутации, но при липса на други тревожни симптоми, няма място за паника. Жените с мутации в тези гени може да бъдат посъветвани да се подлагат на редовен самоизследване и физически прегледи като превантивни мерки. След 40 години има смисъл да се мисли за отстраняване на яйчниците и гърдите; по-младите жени, които не планират да имат деца в бъдеще, понякога се препоръчват да приемат контрацептиви. Решението за тези мерки е изцяло на плещите на самата жена и изисква обмислен подход и консултация с лекари.

Най-новите диагностични методи

Спектрален анализкръвта разкрива наличието на тумори в тялото с вероятност до 93%. Това е сравнително евтин диагностичен метод, който се основава на облъчване на кръвен серум с инфрачервен спектър и анализ на неговия молекулен състав.

Заключението за спектрален кръвен тест се дава на принципа "наличие-отсъствие" и е насочено към идентифициране на повечето видове злокачествени тумори. Този тест може също така да определи етапа на развитие на рака на гърдата. Резултатите се дешифрират в лабораторията и не изискват допълнително лекарско мнение.

За да дарите кръв за спектрален анализ, е необходимо да спрете приема на лекарства 2 месеца преди процедурата. От момента на рентгеново или друго облъчване, както и химиотерапия трябва да минат най-малко 3 месеца. Освен това жената не трябва да е бременна или да има менструация по време на вземането на кръв. Вземането на кръв се извършва на празен стомах през първата половина на деня. Един спектрален кръвен тест отнема средно 12 работни дни.

Един от най-новите методиДиагнозата на рака е така нареченият „фиш тест” (FISH, флуоресцентна хибридизация). Ефективността му все още се обсъжда; основният въпрос за неговата осъществимост е скъпата изследователска процедура. Същността на метода е маркиране на клетъчни фрагменти с флуоресцентен състав и последващо микроскопско изследване на клетките. Въз основа на това с кои части от генетичния материал са свързани белязаните фрагменти, може да се разбере дали пациентът има предразположеност към рак и какви методи на лечение ще бъдат подходящи в конкретен случай.

Тестът FISH не изисква напълно зрели клетки, така че е много по-бърз за изпълнение от други лабораторни тестове. В допълнение, методът FISH ви позволява по-ясно да наблюдавате генетичните увреждания, което е невъзможно да се направи с други видове анализи. Тестът FISH най-често се използва за откриване на рак на гърдата, но работи и за откриване на няколко други вида рак.

Недостатъците на теста FISH включват, в допълнение към високата му цена, неговата неспособност да работи върху някои хромозомни региони поради спецификата на таговете. В допълнение, тестът FISH игнорира някои видове мутации и повреди генетичен код, което може да бъде важен диагностичен пропуск. Сравнителна FISH изследванияс по-евтиния IHC тест не показа значителна полза при определяне на чувствителността на раковите клетки към Herceptin. Въпреки това тестът FISH в момента е най-бързият сред високоточните методи за диагностициране на рак.

FISH е един от най-невероятните „инструменти“ молекулярна биология XXI век. В предимплантационната диагностика изследователската техника FISH се използва за откриване на хромозомни аномалии или нарушения на хромозомното сдвояване в клетките на новополучен ембрион чрез ин витро оплождане (IVF). Ако не се открият аномалии или признаци на анеуплоидия (нарушение на сдвояването, липса на хромозомни двойки), тогава „изкуственият“ ембрион се счита за жизнеспособен. Може да се имплантира в матката на бъдещата майка.

FISH също така дава възможност да се проследят сексуалните характеристики в хромозомния набор на ембриона. Това дава възможност да се определи пола на нероденото дете дори преди действителното настъпване на бременността (ако се счита, че тя започва с имплантирането на извънтелесния заченат ембрион в матката).

Какво е FISH?

Съкращението означава: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, или флуоресцентна in-situ хибридизация. Преписът най-вероятно не казва нищо на невежия читател. Така че нека го разгледаме сложна концепцияна части, оставяйки непреведеното „на място“ за накрая.

Хибридизация

В молекулярната биология този термин има много специално значение, което няма нищо общо с кръстосването на видове в „обикновената“ биология.

Хибридизацията е молекулярно-генетична техника, използвана за оценка на състоянието на ДНК и РНК на изследваните клетки. Основава се на свързването на отделни вериги от нуклеинови киселини в една молекула. По този начин се проверява комплементарността (взаимното съответствие) на молекулите или техните фрагменти помежду си. При пълно допълване веригите лесно и бързо се комбинират в обща молекула. Бавното обединяване показва недостатъчно допълване. Некомплементарността на веригите се дължи именно на хромозомни аномалии (нарушения в реда на хромозомите в определени области), несдвоени хромозоми или липса на някои двойки.

„Инструментът“ за измерване на комплементарността е температурата, при която нишките на ДНК се хибридизират в обща молекула. За да направите това, първо трябва да загреете препарата на нуклеиновата киселина и след това, след като го смесите с друг загрят препарат, да го охладите. При нагряване водородните връзки между веригите на ДНК или РНК изчезват и се образуват едноверижни фрагменти от молекули. Смесени препарати от две ДНК или РНК (или ДНК - РНК) се охлаждат. При охлаждане водородните връзки между комплементарни бази бързо се възстановяват и се образува единична хибридна ДНК молекула (РНК или ДНК - РНК). При липса на допълване процесът отнема повече време, некомплементарните фрагменти остават незакрепени. Следователно, колкото по-висока е температурата на хибридизация, толкова по-хармонична и правилна е хромозомната структура на клетките. Колкото по-ниска е температурата, толкова повече аномалии в хромозомите. Въз основа на анализа на некомплементарни остатъци могат да бъдат идентифицирани специфични аномалии или области на анеуплоидия.

Флуоресцентна маркировка

За анализ на комплементарността на хибридизираща ДНК (или РНК) молекула се използват специални генетични сонди (или ДНК сонди), които, разбира се, също имат малко общо с техните съименници, използвани например в хирургията.

Генетичните проби се синтезират и специално маркират едноверижна ДНК (по-рядко РНК) с предварително определени свойства на комплементарност. Когато се хибридизират, те се сливат с определени генетични фрагменти, като по този начин потвърждават тяхната комплементарност. Местоположението на сондите в хибридизираната молекула показва нормалната или дефектна структура на оригиналния хромозомен материал, от който е сглобена тази „изкуствена структура“.

Генетичните сонди са маркирани по-специално със светещи (флуоресцентни) вещества, което ги прави видими под обектива на специален флуоресцентен микроскоп.

Използването на различни багрила за няколко сонди позволява едновременен анализ на различни генетични структури, например за идентифициране на региони от хромозоми с два насложени един върху друг гена и други аномалии.

Понастоящем при един анализ генетичните проби се маркират с пет до шест различни багрила, понякога дори със седем.

In-situ означава „у дома“

Оригиналната техника на хибридизация беше тромава. Екстрахираната ДНК се денатурира в специални термични буфери и се смесва в центрофуга с други денатурирани фрагменти. Хибридизацията също е извършена в лаборатория, „в химически съд“.

Съвременните технологии позволяват извършването на анализи in situ, тоест „на място“, „у дома“, в оригиналните генетични структури, а не в лабораторни препарати. Обект на изследване са били самите клетъчни ядра (извлечени по време на биопсия на полярни тела, бластомери и повърхностни клетки на бластоциста).

Наблюдаването на генетичния материал директно в клетъчните ядра ускорява процеса, като го прави по-„чист“, свободен от външни влияния и повреди, каквито не са изключени при производството на лабораторни лекарства.

Има обаче проблеми, които сочат непреодолими граници този метод. Една единствена хибридизация не може да „покрие“ целия набор от хромозоми в клетките. Обикновено са необходими две или три последователни хибридизации, позволяващи изследването на 12-15 хромозомни двойки (и има 23 от тях при хората). Способността за по-нататъшна хибридизация на ДНК веригите постепенно намалява след всяка рехибридизация. Това не позволява хибридизацията да се извършва „толкова пъти, колкото желаете“ за изчерпателен анализ на същия генетичен материал.

Инвазивните методи за пренатална диагностика позволяват не само да се погледне в бъдещето и надеждно да се предвиди дали нероденото бебе ще се сблъска със заболявания, свързани с вътрематочни малформации, но и да се установи природата и причините за вродени патологии.

Всяка информация обаче е ценна само ако е навременна. Ако ние говорим заотносно състоянието на развитие на плода, скоростта на получаване на резултатите от теста става жизненоважна.

Следователно методът FISH, който ни позволява да оценим възможно най-много наличието на най-честите аномалии в развитието на ембриона кратко време, е много търсен в генетичната диагностика.

FISH е съкращение, което дешифрира същността на технологията за откриване на хромозомни аномалии - флуоресцентна in situ хибридизация - флуоресцентна хибридизация в "домашна" среда.

Тази техника, предложена в края на 70-те години на миналия век от J. Goll и M.-L. Pardew, се основава на възможността за възстановяване на последователността на фрагменти от нуклеинова киселина (ДНК или РНК) след тяхната денатурация.

Авторите са разработили метод, който позволява, използвайки in situ хибридизация на изкуствено създадени белязани ДНК сонди (сонди) и цитогенетичен материал, взет за анализ, да се идентифицират количествени и качествени отклоненияхромозоми от интерес.

В края на миналия век, след успешното използване на флуоресцентни багрила за оцветяване на ДНК проби, методът FISH получава името си и оттогава интензивно се подобрява и разнообразява.

Съвременните техники за анализ на FISH се стремят да гарантират, че е възможно да се получи най-пълната информация за анализа на избрания генетичен материал в една процедура на хибридизация.

Факт е, че веднъж след хибридизацията могат да бъдат оценени само ограничен брой хромозоми от същия цитогенетичен материал. Способността за повторна хибридизация на ДНК вериги намалява от време на време.

Ето защо в момента в генетичната диагностика методът in situ хибридизация най-често се използва за бърз отговор на въпроси относно съществуващите най-чести анеуплоидии на хромозоми 21, 13, 18, както и на половите хромозоми X, Y.

Всички тъканни или клетъчни проби са подходящи за FISH анализ.

При пренатална диагностика това може да са кръвни проби, еякулат или.

Бързината на получаване на резултатите се осигурява от факта, че клетките, получени от взетия за анализ материал, не е необходимо да се култивират в хранителни среди, като се постига разделянето им до необходимия брой, както при класически начинкариотипиране.

Избраният материал се подлага на специална подготовка за получаване на концентрирана чиста клетъчна суспензия. След това се извършва процесът на денатуриране на ДНК пробата и естествената ДНК на изследваната проба до едноверижно състояние и процесът на хибридизация, по време на който цветните ДНК проби се инкубират с ДНК на пробата.

По този начин се визуализират желаните (цветни) хромозоми в клетката, оценява се техният брой, структурата на генетичните структури и др. Окулярът на специален флуоресцентен микроскоп ви позволява да изследвате светещите ДНК вериги.

В момента методът FISH се използва широко за диагностични цели за идентифициране генетични заболявания, хромозомни аберации в репродуктивната медицина, онкологията, хематологията, биологичната дозиметрия и др.

Как се използва FISH диагностика на плода?

В областта на репродуктивната медицина методът FISH, като един от методите на молекулярната цитогенетична диагностика, се използва на всички етапи.

• двойка.

За да се определи кариотипът на бъдещите родители, той се извършва веднъж, тъй като човешкият геном остава непроменен през целия живот.

Кариотипирането на двойка преди зачеването на дете ще помогне да се установи дали родителите са носители на генетични патологии, които са наследени, включително скрити. И общо състояниегенома на бъдещата майка и баща, което може да повлияе на успеха на зачеването на бебе и носенето на бременност до термина.

Диагностиката с помощта на метода FISH в този случай често действа като допълнителен прегледдо класическо кариотипиране, при идентифициране на хромозомни патологии в тестовия материал (венозна кръв на родителите), ако има съмнение за мозаицизъм.

Допълнителният преглед по метода FISH надеждно ще потвърди или отхвърли наличието на предполагаема аномалия в клетките на бъдещия родител.

• Изследване на еякулата.

Показан при затруднения с размножаването в двойка поради „мъжкия фактор“. Анализът на спермата с помощта на метода FISH ще ви позволи да оцените нивото на отклонение хромозомен наборсперматозоиди, както и определят дали мъжът е носител на генетични заболявания, свързани с пола.

Ако двойката впоследствие прибегне до зачеване чрез IVF, FISH анализът на еякулата ще позволи избора на най-висококачествената сперма за оплождане на яйцеклетката.

• С IVF.

За предимплантационна генетична диагностика (PGD). Въз основа на резултатите от изследванията на кариотипа на родителите се определят възможните хромозомни и генетични аберации, които могат да бъдат предадени на ембриона.

Благодарение на възможностите на диагностиката FISH, изследване на генетичното здраве на получените ембриони може да се извърши за броени часове преди трансфер в маточната кухина, за да се гарантира бременност с известен здрав плод.

В допълнение, възможностите на PGD позволяват да се определи пола на ембрионите и следователно да се „поръча“ пола на нероденото дете, ако е необходимо.

• По време на бременност.

В пренаталната диагностика: анализ на фетални клетки, получени чрез хорионбиопсия, амниоцентеза или кордоцентеза по метода FISH, обикновено се предлага от медицинските центрове в допълнение към класическия генетични изследванияфетални клетки (кариотипиране).

Този метод е незаменим, когато е необходимо бързо да се получи отговор за наличието на най-често срещаните хромозомни дефекти в плода: тризомия на хромозоми 21, 18, 13, аберации в хромозоми X и Y, понякога и анеуплоидии на хромозоми 14 (или 17), 15, 16.

Предимства на FISH анализа

Провеждането на генетичен анализ по метода FISH, въпреки че днес остава спомагателен метод за диагностициране на хромозомни патологии, осъществимостта на неговото прилагане се определя от неоспорими предимства:

• скоростта на получаване на резултати по отношение на изследваните хромозоми е в рамките на няколко часа - не повече от 72.

Това може да е важно, ако съдбата на бременността зависи от диагнозата на генетиците;

• висока чувствителност и надеждност на метода FISH - успешен анализ е възможен върху незначително количество биоматериал - една клетка е достатъчна, грешката на резултатите е не повече от 0,5%.

Това може да е важно, когато броят на клетките в оригиналната проба е ограничен, например, когато тяхното делене е лошо.

• възможността за извършване на диагностика с помощта на метода FISH на всеки етап от бременността (от 7-та седмица) и използване на всяка биологична проба: фрагменти от хорион, амниотична течност, фетална кръв и др.

Къде мога да направя диагностика по метода FISH?

В Москва методът FISH за пренатална диагностика на хромозомни аномалии на плода се използва в следните медицински центрове:

По правило клиниките предлагат диагностични услуги FISH като част от пълното кариотипиране на плода чрез инвазивна интервенция срещу допълнително заплащане. И като правило бъдещите родители се съгласяват да плащат допълнително, защото благодарение на метода FISH само за няколко дни можете да разберете най-важните неща за вашето бебе