Tradičná cytogenetika pri štúdiu karyotypu bol vždy limitovaný pásovou úrovňou rozlíšenia. Dokonca aj s rozdielnym farbením chromozómov s vysokým rozlíšením sme našli iba viac pásov na chromozóm, ale neboli sme si istí, či sa dostávame na molekulárnu úroveň rozlíšenia. Najnovšie úspechy DNA technológie a cytogenetika umožnili použiť metódy FISH na analýzu zmien v chromozomálnej DNA na molekulárnej úrovni. Molekulárna cytogenetika priniesla revolučný prelom v cytogenetike, ktorý umožňuje:

Analyzovať štruktúru DNA chromozómov v rozsahu 10-100 kilobáz;
na diagnostiku nedeliacich sa medzifázových buniek, čo malo obrovský vplyv na prenatálnu diagnostiku a preimplantačnú genetickú diagnostiku (PGD).

Technológia FISH používa DNA sondu, ktorá viaže alebo renaturuje špecifické DNA sekvencie v chromozóme. Denaturovaná sonda sa inkubuje s natívnou bunkovou DNA, tiež denaturovanou do jednovláknového stavu. Sonda nahrádza biotín deoxyuridín trifosfát alebo digoxigenín uridín trifosfát tymidínom. Po renaturácii natívnej DNA sondou možno komplex sonda-DNA detegovať pridaním biotín-viažuceho avidínu značeného fluorochrómom alebo antidigoxigenínu značeného fluorochrómom. Ďalšie zosilnenie signálu možno získať pridaním antiavidínu a skúmaním výsledného komplexu pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Označením rôznych DNA sond niekoľkými rôznymi fluorochrómami možno súčasne zobraziť niekoľko chromozómov alebo chromozómových segmentov v jednej bunke ako viacfarebné signály.

Schopnosť definovať špecifické génové segmenty, prítomné alebo neprítomné na chromozómoch, umožnili diagnostikovať syndrómy génových sekvencií na úrovni DNA, ako aj translokácie v interfázových jadrách, často v jednotlivých bunkách.

materiál pre RYBY môže slúžiť resp metafázové chromozómy odvodené z deliacich sa buniek alebo medzifázové jadrá z buniek, ktoré nie sú v štádiu delenia. Rezy sa vopred ošetria RNázou a proteinázou, aby sa odstránila RNA, ktorá môže krížovo hybridizovať so sondou a chromatínom. Potom sa zahrievajú vo formamide, aby sa denaturovala DNA a fixovali sa ľadovo studeným alkoholom. Sonda sa potom pripraví na hybridizáciu zahrievaním. Potom sa sonda a prípravok chromozómov zmiešajú a uzatvoria sa krycím sklíčkom pri 37 °C na hybridizáciu. Zmenou inkubačnej teploty alebo zloženia soli hybridizačného roztoku sa môže zvýšiť väzbová špecificita a môže sa znížiť značenie pozadia.

Aplikácia fluorescenčnej in situ hybridizácie - FISH technológia

Účinnosť technológie FISH bola prvýkrát preukázaná lokalizáciou génov do . So zavedením metódy fluorescenčného značenia sa in situ hybridizácia stala nevyhnutnou pre diagnostiku chromozomálnych abnormalít, ktoré nie sú detekované tradičné metódy páskovanie. RYBY tiež zohrali kľúčovú úlohu pri jednom z najvýnimočnejších objavov moderná genetika- genomický imprinting.

Jeho vývojová technológia RYBY prijímané v troch formách. Centromerické alebo alfa-satelitné sondy sa vyznačujú relatívnou chromozomálnou špecifickosťou, najčastejšie sa používali v genetike interfázových buniek. Tieto sondy generujú trochu difúzne signály primeranej sily v oblasti centroméry, ale nehybridizujú sa s chromozómami s podobnými centromérnymi sekvenciami. V súčasnosti boli vyvinuté jednokópiové sondy, ktoré poskytujú diskrétny signál zo špecifického chromozómového pásu a umožňujú vyhnúť sa fenoménu krížovej hybridizácie. Tieto sondy sa môžu použiť aj na určenie počtu kópií a špecifických chromozomálnych oblastí, o ktorých je podozrenie, že sú spojené s daným syndrómom. Na prenatálnu diagnostiku sa používajú jednokópiové a centromerické sondy určené pre chromozómy 13, 18, 21, X a Y.

Je tiež možné "zafarbiť" celé chromozómy RYBY. Vďaka technológii spektrálnej karyotypizácie, ktorá využíva zmes rôznych fluorochrómov, je teraz možné vytvoriť jedinečný fluorescenčný vzor pre každý jednotlivý chromozóm s 24 jednotlivými farbami. Táto technológia umožňuje pomocou tradičných cytogenetických techník určiť zložité chromozomálne prestavby, ktoré nie sú viditeľné.

Metóda RYBY v prenatálnej diagnostike. Pre ženy vo vyššom reprodukčnom veku môže byť tehotenstvo dôvodom nie tak na radosť, ale na obavy. S vekom ženy je spojené riziko vzniku chromozomálnych abnormalít plodu. Amniocentéza, vykonaná v 16. týždni tehotenstva, po ktorej nasleduje analýza karyotypu, trvá 10-14 dní. Použitie FISH pri predbežnom vyšetrení umožňuje rýchlejšiu diagnostiku a skrátenie čakacích lehôt. Väčšina genetikov a laboratórií zastáva názor, že metóda FISH by sa pri rozhodovaní o budúcom manažmente tehotenstva nemala používať izolovane. Metóda FISH musí byť doplnená o karyotypový rozbor a jej výsledky by mali minimálne korelovať s patologickým obrazom. ultrazvuk(ultrazvuk) alebo biochemický skríning z krvi matky.

Syndrómy génov sekvencie tiež známy ako mikrodelečné syndrómy alebo segmentálna aneusómia. Ide o delécie susedných fragmentov chromozómu, ktoré zvyčajne zahŕňajú mnoho génov. Syndrómy génovej sekvencie boli prvýkrát opísané v roku 1986 pomocou klasických cytogenetických techník. Teraz je vďaka FISH možné identifikovať submikroskopické delécie na úrovni DNA, čo umožnilo identifikovať najmenšiu deletovanú oblasť spojenú s rozvojom konkrétneho syndrómu, nazývanú kritická oblasť. Po identifikácii kritickej oblasti pre syndróm je často možné identifikovať špecifické gény, ktorých absencia sa považuje za súvisiacu so syndrómom. Nedávna príručka o syndrómoch génovej sekvencie uvádza 18 syndrómov delécie a mikrodelecie spojených so 14 chromozómami. Niektoré z najčastejších syndrómov génovej sekvencie a ich klinické prejavy sú uvedené v tabuľke. 5-2.

teloméry- útvary, ktoré pokrývajú konce dlhých a krátkych ramien chromozómov. Pozostávajú z opakujúcich sa sekvencií TTAGGG a zabraňujú fúzii koncov chromozómov. Telomérne sondy hrajú dôležitú úlohu pri rozpoznávaní komplexných translokácií, ktoré nie je možné určiť tradičnými cytogenetickými metódami. Okrem toho jedným z objavov Human Genome Project bola skutočnosť, že oblasti chromozómov susediace s telomérami sú bohaté na gény. Teraz sa ukázalo, že submikroskopické subtelomérne delécie sú zodpovedné za výskyt mnohých geneticky podmienených chorôb.

Stanovenie stavu nádoru HER-2 metódou FISH- štúdium predispozície k rozvoju nádoru a výber včasnej adekvátnej liečby rakoviny prsníka (BC) alebo rakoviny žalúdka (GC).

HER-2 (HER-2/neu)- ľudský receptor epidermálneho rastového faktora-2 je proteín, ktorý môže ovplyvňovať rast rakovinové bunky. Vytvára ho špeciálny gén nazývaný HER-2/neu gén. HER-2 je receptor pre špecifický rastový faktor nazývaný ľudský epidermálny rastový faktor, ktorý sa prirodzene vyskytuje u ľudí. Keď sa ľudský epidermálny rastový faktor naviaže na receptory HER-2 na bunkách rakoviny prsníka, môže stimulovať rast a delenie týchto buniek. V zdravom tkanive HER-2 prenáša signály, ktoré regulujú bunkovú proliferáciu a prežitie, ale nadmerná expresia HER-2 môže viesť k malígnej bunkovej transformácii.

Hyperexpresia HER-2 u niektorých podtypov rakoviny prsníka vedie k zvýšenej proliferácii a angiogenéze, dysregulácii apoptózy (geneticky naprogramovaná autodeštrukcia buniek). Ukázalo sa, že pri rakovine prsníka je nadmerná expresia tohto receptora v nádorovom tkanive spojená s agresívnejším priebehom ochorenia, zvýšeným metastatickým potenciálom nádoru a menšou priaznivá prognóza. Objav asociácie nadmernej expresie HER-2 so zlou prognózou rakoviny prsníka viedol k hľadaniu takých liečebných prístupov, ktoré sú zamerané na špecifické blokovanie onkogénu HER-2/neu (cielená anti-HER2 terapia).

Rakovina prsníka (BC) - zhubný nádor žľazové tkanivo mliečna žľaza. RZhM zaujíma prvé miesto medzi všetkými malígnymi ochoreniami u žien.

V závislosti od prítomnosti biologických markerov nádoru - expresia hormonálnych receptorov (estrogén a / alebo progesterón), sa izoluje expresia HER-2 - hormonálny receptor-pozitívny, HER-2-pozitívny a triple negatívny karcinóm prsníka.

HER-2/neu-pozitívne (HER-2+) typy rakoviny prsníka sa vyznačujú vysokou expresiou proteínu HER-2/neu.
HER=2/neu-negatívne (HER-2-) typy rakoviny prsníka sú charakterizované nízkou expresiou alebo absenciou HER-2/neu proteínu.
Odhaduje sa, že jedna z piatich žien s rakovinou prsníka je HER-2 pozitívna. Väčšina karcinómov prsníka je závislá od hormónov: estrogény a progesterón majú na ne stimulačný účinok (proliferatívny a neoplastický). Pri HER-2-pozitívnom karcinóme prsníka je na povrchu nádorových buniek prítomný nadbytok HER-2 receptorov. Tento jav sa nazýva "pozitívny HER-2-status" a je diagnostikovaný u 15-20% žien s rakovinou prsníka.

HER-2- receptor ľudského epidermálneho rastového faktora typu 2, ktorý je prítomný v tkanivách a normálne, podieľa sa na regulácii bunkového delenia a diferenciácie. Jeho nadbytok na povrchu nádorových buniek (hyperexpresia) podmieňuje rýchly nekontrolovaný rast novotvaru, vysoké riziko metastáz a nízku účinnosť niektorých typov liečby. HER-2 pozitívna rakovina prsníka je obzvlášť agresívna forma túto chorobu, Preto presná definícia Stav HER-2 má kľúčový význam pre výber taktiky liečby.

Rakovina žalúdka (SC)- zhubný nádor pochádzajúci z epitelu sliznice žalúdka.

Karcinóm žalúdka je na 4. mieste v štruktúre onkologickej morbidity a na 2. mieste v štruktúre onkologickej mortality vo svete. Výskyt rakoviny žalúdka u mužov je 2-krát vyšší ako u žien. Rusko patrí k regiónom s vysokým výskytom rakoviny žalúdka a úmrtnosťou na toto ochorenie. Diagnóza gastroezofageálneho skoré štádiaťažké vzhľadom na dlhý asymptomatický priebeh ochorenia. Rakovina žalúdka sa často zistí v neskorých štádiách, keď 5-ročná miera prežitia nepresahuje 5-10% a chemoterapia zostáva jedinou liečbou.

Hlavnou metódou liečby rakoviny žalúdka je chirurgická liečba. U väčšiny pacientov sa však v čase diagnózy stanoví rozšírený nádorový proces, ktorý znemožňuje vykonať radikálnu operáciu a vyžaduje systémovú medikamentózna terapia. Vedenie chemoterapie štatisticky významne zvyšuje celkové prežívanie pacientov s metastatickým karcinómom žalúdka a zlepšuje kvalitu ich života.

HER-2 onkogén (erbB-2) bol pôvodne identifikovaný v nádoroch prsníka. Amplifikácia a nadmerná expresia tohto génu je relatívne špecifickou udalosťou pre karcinómy prsníka a prakticky sa nevyskytuje u nádorov inej lokalizácie. Rakovina žalúdka sa zdá byť jednou z mála výnimiek: aktivácia HER-2 je zaznamenaná približne v 10-15 % prípadov. zhubné novotvary tohto orgánu a koreluje s agresívnym priebehom ochorenia.

Nadmerná expresia HER-2 je zlým prognostickým faktorom. Podľa rôznych štúdií amplifikácia génu HER-2 u pacientov s rakovinou žalúdka koreluje s nízkou celkovou mierou prežitia.

Metóda FISH sa používa na hodnotenie stavu HER-2 v GC a BC.

RYBY- výskum umožňuje určiť kvalitatívne a kvantitatívne zmeny v chromozómoch pre diagnostiku malígnych krvných ochorení a solídnych nádorov.

Dnes sú štúdie FISH široko používané po celom svete.

Metóda FISH (fluorescenčná hybridizácia in situ) - štúdium počtu HER-2/neu-génov vo vnútri rakovinových buniek.

Indikácie:

• rakovina prsníka - na účely prognózy a výberu terapie;
• rakovina žalúdka - na účely prognózy a výberu terapie.

Príprava
Určené ošetrujúcim lekárom.

Vyžaduje sa histologický protokol a imunohistochemický protokol, IHC sklo.

Interpretácia výsledkov
Výsledky testu FISH sú vyjadrené takto:

1. Pozitívne (zvýšený obsah, dochádza k amplifikácii génu HER-2):

• HER-2 pozitívna rakovina prsníka;

2. Negatívny (žiadna amplifikácia génu HER-2):

• HER-2 negatívna rakovina prsníka.

Rakovina prsníka - nebezpečná choroba, ktorá je podľa štatistík na prvom mieste medzi nádorovými ochoreniami u žien. Riziko vzniku tohto ochorenia sa zvyšuje u všetkých žien nad 40 rokov a môže byť spôsobené niekoľkými ďalšími faktormi. Medzi najpravdepodobnejšie príčiny rakoviny prsníka patrí obezita, genetická alebo dedičná predispozícia, skorý štart menštruácia a ich neskoré ukončenie, hormonálna alebo radiačná terapia.

Okrem toho je riziko chorobnosti zvýšené u nulipar a žien, ktoré už mali rakovinu. U mužov sa môže vyvinúť aj rakovina prsníka.

Typy a metódy diagnostiky

Prvým krokom pri diagnostike rakoviny prsníka je rutinné vyšetrenie u mamológa. Ženy nad 40 rokov by mali absolvovať tieto prehliadky aspoň raz za dva roky. Lekár vykonáva vizuálne vyšetrenie, palpáciu a mamografiu mliečnych žliaz. Vizuálne príznaky vývoja ochorenia môžu byť:

všeobecné informácie

Röntgenové vyšetrenie prsníka (mamografia) umožňuje určiť prítomnosť, veľkosť a umiestnenie nádoru. Na zlepšenie presnosti získaných výsledkov sa používa technológia zavádzania kontrastnej látky. Ak už bol nádor zistený, potom sa použije metóda pneumocystografie - odstránenie nádorovej tekutiny a zavedenie vzduchu do dutiny. Ak nie je špecifikovaná prítomnosť nádoru, potom sa používa duktografia - zavedenie kontrastnej látky do mliekovodov.

Tieto metódy umožňujú vizualizovať prítomnosť útvarov v tkanivách mliečnej žľazy.

Ak sa prítomnosť nádoru prejaví aj na mamografii, pacientka dostane odporúčanie na súbor diagnostických opatrení:

Na ultrazvuku doktor dokáže rozlíšiť nádor od cysty a objasniť lokalizáciu formácie. Potom sa z nej odoberie vzorka tkaniva na biopsiu. Biopsia vám umožňuje zistiť typ formácie: benígny alebo malígny a tiež určiť, či je nádor závislý od hormónov. Tieto informácie umožňujú lekárovi rozhodnúť o liečebnej stratégii, ale nie vždy umožňujú určiť štádium. Často aj so všetkým potrebným diagnostické opatrenia dá sa to určiť až po operácii.

Mechanizmus histologických štúdií

Pred aj po operácii sa vykonáva biopsia tkaniva. Postup sa vykonáva po objasnení lokalizácie vzdelávania.

Biopsia je proces odstránenia kúska tkaniva a jeho štúdium sa nazýva "histologické vyšetrenie" alebo jednoducho "histológia".

Zdravotnícky pracovník pomocou špeciálnej ihly odoberie z novotvaru malé množstvo tkaniva alebo už odstránený nádor z tela pacienta odošle na histologické vyšetrenie. Potom sa fragment tkaniva zafarbí a spracuje špeciálnym spôsobom, aby sa zvýšil kontrast a uľahčilo sa štúdium. Rez je vyšetrený mikroskopom odborníkom a dáva záver o kvalite tvorby nádoru. Veľa v tejto štúdii závisí od pozornosti a kvalifikácie laboratórneho asistenta, ktorý dáva záver.

Súvisiaca štúdia je imunohistochémia. Vo všeobecnosti ju možno nazvať aj „histológiou“, pretože. metóda je založená na štúdiu tkanív, ale imunohistochémia je pokročilejšia metóda analýzy. Tkanivo v tejto štúdii je tiež zafarbené špeciálnymi činidlami, ktoré nielen zvyšujú vizuálny kontrast, ale tiež sa špeciálnym spôsobom kombinujú („označujú“) s protilátkami, čo umožňuje špecifikovať viac charakteristík novotvaru. Reakcia v tomto prípade prebieha oveľa rýchlejšie, čo vám umožňuje rýchlo získať výsledky analýzy.

Imunohistochémia umožňuje nielen objasniť typ novotvaru, ale aj naplánovať stratégiu liečby pacienta založenú na detekcii citlivosti nádorového tkaniva na rôzne druhy terapeutický účinok. Okrem toho je vykonávanie tejto štúdie čo najviac automatizované, čo minimalizuje pravdepodobnosť diagnostickej chyby spôsobenej ľudským faktorom.

Existujú aj moderné diagnostické opatrenia, ktoré umožňujú zistiť prítomnosť nádoru v tele: ide o spektrálny rozbor krvi, imunologický (biochemický) rozbor, FISH test nádorového tkaniva. Genetický krvný test umožňuje každej žene overiť prítomnosť alebo absenciu predpokladov pre výskyt rakoviny prsníka. CT a MRI umožňujú presne určiť lokalizáciu nádoru a vysledovať dynamiku jeho vývoja, vyhodnotiť štruktúru novotvaru.

Ako zistiť rakovinu krvným testom?

Krvný test predpisuje najmä lekár po ultrazvukovom vyšetrení. Sú situácie, keď pacient vlastnej iniciatívy daruje krv na markery okien alebo genetickú analýzu, aby zistila, či majú predispozíciu na rakovinu prsníka. V niektorých prípadoch všeobecná analýza krv môže slúžiť ako dôvod na kontaktovanie onkologického dispenzára (spolu s palpáciou tesnenia alebo vizuálnymi príznakmi rakoviny).

Biochemická analýza

Krv ako materiál pre výskum umožňuje nasledujúce diagnostické opatrenia:

Zároveň iba prvé dve analýzy možno nazvať špecializovanými metódami na stanovenie rakoviny, z ktorých druhá je skôr preventívnym opatrením ako operačným. Pred operáciou sa vykonávajú ďalšie dva krvné testy, aby sa zistil stav tela a rozsah procesu. Avšak, ako už bolo uvedené, ak sa v hrudníku cíti pečať a súčasne všeobecný krvný test ukazuje viac ako dva negatívne diagnostické koeficienty, je to dôvod na kontaktovanie špecialistu. Negatívne koeficienty sú ukazovatele mimo normy v určitých parametroch zloženia krvi.

Biochemický krvný test odhalí prítomnosť protilátok proti nádorovým bunkám. Takéto telieska sa nazývajú nádorové markery. Počet a typ nádorových markerov závisí od špecifík (lokalizácie) rakovinový nádor a etapách jeho vývoja. Nádorové markery zahŕňajú:

Pri rakovine prsníka bude ošetrujúceho lekára v prvom rade zaujímať prítomnosť nádorového markera CA-15-3, keďže jeho prítomnosť v krvi jednoznačne poukazuje na rakovinové ochorenie prsníka. Dešifrovanie výsledku trvá v priemere jeden deň. Biochemická analýza sa vykonáva niekoľkokrát v priebehu ochorenia. Krv pre neho sa odoberá zo žily ráno na prázdny žalúdok. Dva týždne pred testom pacient prestane užívať všetko lieky(upresní ošetrujúci lekár). Dva dni pred darovaním krvi nemôžete užívať alkohol, mastné a vyprážané jedlá.

Hodinu pred procedúrou nemôžete fajčiť a je žiaduce znížiť emocionálny stres. Krv na biochemická analýza zvyčajne sa nevzdávajte ihneď po ožarovaní a fyzioterapii.

Definícia genetických faktorov

Predtým, ako hovoríme o genetickom krvnom teste, je potrebné zdôrazniť rozdiel medzi pojmami „genetický“ a „dedičný“. genetický faktor výskyt rakoviny je širší pojem, ktorý zahŕňa nielen prítomnosť príbuzných s rakovinou prsníka, ale aj špecifickú génovú mutáciu, vďaka ktorej sa riziko tohto ochorenia zvyšuje.

Dedičný faktor implikuje potenciálne riziko rakoviny prsníka na základe rodinnej anamnézy. Zároveň nielen ženy, ale aj muži môžu dostať mutantný gén, ale jeho nosič nemusí nevyhnutne ochorieť.

Každá žena môže podstúpiť genetickú analýzu. Toto sa odporúča najmä tým, ktorých priami príbuzní mali rakovinu prsníka. Pred postupom darovania krvi na analýzu by sa mal s pacientom porozprávať odborník v oblasti genetiky, ktorý mu vysvetlí nuansy dešifrovania výsledkov. Pred darovaním krvi sa od pacienta nevyžaduje žiadna špeciálna príprava.

V prípade prijatia pozitívny výsledok mutácie v génoch BRCA, ale v neprítomnosti iných úzkostné symptómy, netreba robiť paniku. Ženám s mutáciou týchto génov možno ako preventívne opatrenia odporučiť pravidelné samovyšetrenie a fyzikálne vyšetrenia. Po 40 rokoch má zmysel uvažovať o odstránení vaječníkov a prsníkov, mladším ženám, ktoré v budúcnosti neplánujú mať deti, sa niekedy odporúča brať antikoncepciu. Rozhodnutie o týchto opatreniach leží výlučne na pleciach samotnej ženy a vyžaduje si premyslený prístup a konzultácie s lekármi.

Najnovšie diagnostické metódy

Spektrálna analýza krv odhalí prítomnosť novotvarov v tele s pravdepodobnosťou až 93%. Ide o relatívne lacnú diagnostickú metódu založenú na infračervenom ožiarení krvného séra a analýze jeho molekulárneho zloženia.

Záver o spektrálnej analýze krvi je daný na princípe "prítomnosť-neprítomnosť" a je zameraný na identifikáciu väčšiny typov zhubných nádorov. Táto štúdia je tiež schopná určiť štádium vývoja rakoviny prsníka. Interpretácia výsledkov prebieha v laboratóriu a nevyžaduje ďalšie vyjadrenie lekára.

Aby bolo možné darovať krv na spektrálnu analýzu, je potrebné absolvovať príjem liekov 2 mesiace pred zákrokom. Od okamihu röntgenovej alebo inej expozície, ako aj chemoterapie, musia prejsť najmenej 3 mesiace. Okrem toho žena v čase odberu krvi nesmie byť tehotná ani menštruovať. Odber krvi prebieha ráno nalačno. Spektrálna analýza krvi trvá v priemere 12 pracovných dní.

Jeden z najnovšie metódy diagnostika rakoviny je takzvaný "rybí test" (FISH, fluorescenčná hybridizácia). O jeho účinnosti sa stále diskutuje, hlavnou otázkou jeho realizovateľnosti je nákladný výskumný postup. Podstata metódy spočíva v označení bunkových fragmentov fluorescenčnou kompozíciou a ďalšom mikroskopickom vyšetrení buniek. Podľa toho, ktoré časti genetického materiálu označené fragmenty kontaktovali, možno pochopiť, či má pacient predispozíciu na rakovinu a aké metódy liečby budú v konkrétnom prípade relevantné.

Test FISH nevyžaduje úplne zrelé bunky, takže táto analýza je oveľa rýchlejšia ako iné laboratórne testy. Okrem toho vám metóda FISH umožňuje jasnejšie pozorovať genetické poškodenie, čo pri iných typoch analýz nie je možné. FISH test sa najčastejšie používa špeciálne na zistenie rakoviny prsníka, ale funguje aj na detekciu niektorých iných typov rakoviny.

Medzi nevýhody testu FISH patrí okrem vysokej ceny aj nemožnosť pracovať na niektorých častiach chromozómov kvôli špecifickosti znamienok. Okrem toho test FISH ignoruje určité typy mutácií a porúch. genetický kód, čo môže byť dôležitým opomenutím v diagnostike. Porovnávací FISH štúdie s lacnejším IHC testom neodhalili významné výhody pri určovaní citlivosti rakovinových buniek na Herceptin. Napriek tomu je test FISH v súčasnosti najrýchlejší spomedzi vysoko presných metód diagnostiky rakoviny.

RYBA je jeden z najúžasnejších „nástrojov“ molekulárna biológia XXI storočia. V preimplantačnej diagnostike sa výskumná technika FISH používa na detekciu chromozomálnych abnormalít alebo porúch párovania chromozómov v bunkách embrya, ktoré bolo práve získané oplodnením in vitro (IVF). Ak sa nezistia žiadne anomálie alebo známky aneuploidie (poruchy párovania, nedostatok chromozómových párov), potom sa „umelé“ embryo považuje za životaschopné. Môže byť implantovaný do maternice nastávajúcej matky.

FISH tiež umožňuje sledovať sexuálne charakteristiky v chromozómovej sade embrya. To umožňuje určiť pohlavie nenarodeného dieťaťa ešte pred samotným nástupom tehotenstva (ak to považujeme za začiatok uhniezdenia mimotelovo počatého embrya do maternice).

Čo je RYBA?

Skratka znamená: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung alebo fluorescenčná in-situ hybridizácia. Prepis s najväčšou pravdepodobnosťou neznalému čitateľovi nič nehovorí. Preto budeme analyzovať komplexný koncept po častiach, pričom nepreložené „in-situ“ ponechávame ako posledné.

Hybridizácia

V molekulárnej biológii má tento pojem veľmi zvláštny význam, ktorý nemá nič spoločné s krížením druhov v „obyčajnej“ biológii.

Hybridizácia je molekulárna genetická technika používaná na hodnotenie stavu DNA a RNA študovaných buniek. Je založená na spojení jednotlivých reťazcov nukleových kyselín do jedinej molekuly. Kontroluje sa teda komplementarita (vzájomná zhoda) molekúl alebo ich fragmentov. S úplnou komplementaritou sa reťazce ľahko a rýchlo spoja do spoločnej molekuly. Pomalá asociácia naznačuje nedostatočnú komplementaritu. Nekomplementárnosť reťazcov je spôsobená práve chromozomálnymi abnormalitami (porušenie poradia chromozómov v určitých oblastiach), nepárovými chromozómami alebo absenciou niektorých párov.

„Nástrojom“ na meranie komplementarity je teplota, pri ktorej reťazce DNA hybridizujú do spoločnej molekuly. Aby ste to dosiahli, musíte najskôr zahriať prípravok nukleovej kyseliny a po zmiešaní s iným zahriatym prípravkom ho ochladiť. Pri zahrievaní miznú vodíkové väzby medzi reťazcami DNA alebo RNA, vytvárajú sa jednovláknové fragmenty molekúl. Zmiešané prípravky dvoch DNA alebo RNA (alebo DNA - RNA) sa ochladia. Po ochladení sa vodíkové väzby medzi komplementárnymi bázami rýchlo obnovia, vytvorí sa jediná, hybridná molekula DNA (RNA alebo DNA - RNA). Pri nedostatku komplementarity proces trvá dlhšie, nekomplementárne fragmenty zostávajú nepripojené. Preto čím vyššia je teplota hybridizácie, tým je chromozomálna štruktúra buniek harmonickejšia a správnejšia. Čím nižšia je teplota, tým viac abnormalít v chromozómoch. Na základe analýzy nekomplementárnych rezíduí možno identifikovať špecifické anomálie alebo oblasti aneuploidie.

Fluorescenčné značenie

Na analýzu komplementarity hybridizujúcej molekuly DNA (alebo RNA) sa používajú špeciálne genetické sondy (alebo sondy DNA), ktoré, samozrejme, tiež nemajú veľa spoločného so svojimi menovcami používanými napríklad v chirurgii.

Genetické sondy sú syntetizované a špeciálne značené jednovláknové DNA (zriedka RNA) s vopred určenými vlastnosťami komplementarity. Pri hybridizácii sa spájajú s určitými genetickými fragmentmi, čím sa potvrdzuje ich komplementarita. Umiestnenie sond v hybridizovanej molekule indikuje normálnu alebo defektnú štruktúru pôvodného chromozomálneho materiálu, z ktorého je táto "umelá štruktúra" zostavená.

Genetické sondy sú označené najmä svietiacimi (fluorescenčnými) látkami, vďaka čomu sú viditeľné pod šošovkou špeciálneho fluorescenčného mikroskopu.

Použitie rôznych farbív pre niekoľko sond umožňuje súčasnú analýzu rôznych genetických štruktúr, napríklad na identifikáciu oblastí chromozómov s dvoma génmi superponovanými na seba a inými anomáliami.

V súčasnosti sa pri vykonávaní jednej analýzy genetické sondy označujú piatimi alebo šiestimi rôznymi farbivami, niekedy dokonca siedmimi.

In-situ znamená „doma“

Pôvodná hybridizačná technika bola ťažkopádna. Extrahovaná DNA bola denaturovaná v špeciálnych tepelných pufroch, zmiešaná v centrifúge s inými denaturovanými fragmentmi. Hybridizácia sa uskutočnila aj v laboratóriu, „v chemickom skle“.

Moderná technika umožňuje vykonávať analýzy in situ, teda „na mieste“, „doma“, v pôvodných genetických štruktúrach a nie v laboratórnych preparátoch. Predmetom štúdie boli samotné bunkové jadrá (polárne telieska, blastoméry, povrchové bunky blastocysty extrahované počas biopsie).

Pozorovanie genetického materiálu priamo v jadrách buniek proces urýchľuje, robí ho „čistejším“, zbaveným vonkajších vplyvov a poškodení, ktoré nie sú vylúčené pri výrobe laboratórnych preparátov.

Existujú však problémy, ktoré poukazujú na neprekonateľné hranice. túto metódu. Jediná hybridizácia nemôže „pokryť“ celú sadu chromozómov v bunkách. Zvyčajne sú potrebné dve alebo tri po sebe nasledujúce hybridizácie, ktoré umožňujú štúdium 12-15 párov chromozómov (a u ľudí je ich 23). Schopnosť ďalšej hybridizácie v reťazcoch DNA po každej rehybridizácii postupne klesá. To neumožňuje hybridizáciu „toľkokrát, koľkokrát chcete“ pre vyčerpávajúcu analýzu toho istého genetického materiálu.

Invazívne metódy prenatálnej diagnostiky umožňujú nielen nahliadnuť do budúcnosti a spoľahlivo predpovedať, či ešte nenarodené dieťatko čakajú choroby spojené s vnútromaternicovými malformáciami, ale aj zistiť povahu a príčiny vrodených patológií.

Akákoľvek informácia je však cenná len vtedy, keď je aktuálna. Ak rozprávame sa o stave vývoja plodu je rýchlosť získania výsledkov testov životne dôležitá.

Preto metóda FISH, ktorá umožňuje posúdiť prítomnosť najčastejších vývojových anomálií embrya v max. krátka doba, je v genetickej diagnostike veľmi žiadaný.

FISH je skratka, ktorá dešifruje podstatu technológie zisťovania chromozomálnych abnormalít – fluorescenčná in situ hybridizácia – fluorescenčná hybridizácia v „domácom“ prostredí.

Táto technika, navrhnutá koncom 70. rokov minulého storočia J. Gollom a M.-L. Pardew je založený na možnosti obnovenia sekvencie fragmentov nukleových kyselín (DNA alebo RNA) po ich denaturácii.

Autori vyvinuli metódu, ktorá umožňuje pomocou in situ hybridizácie umelo vytvorených značených DNA sond (sond) a cytogenetického materiálu odobratého na analýzu identifikovať kvantitatívne a kvalitatívne odchýlky chromozómy záujmu.

Koncom minulého storočia, po úspešnom použití fluorescenčných farbív na farbenie DNA sond, dostala metóda FISH svoj názov a odvtedy sa intenzívne zdokonaľuje a obmieňa.

Moderné metódy FISH-analýzy sa snažia poskytnúť možnosť získania najúplnejších informácií na analýzu zozbieraného genetického materiálu v jedinom hybridizačnom postupe.

Faktom je, že len obmedzený počet chromozómov toho istého cytogenetického materiálu možno po hybridizácii vyhodnotiť raz. Schopnosť rehybridizácie reťazcov DNA sa z času na čas znižuje.

Preto sa v súčasnosti v genetickej diagnostike najčastejšie používa metóda in situ hybridizácie na rýchle zodpovedanie otázok o najčastejších aneuploidiách pre chromozómy 21, 13, 18, ako aj pre pohlavné chromozómy X, Y.

Na analýzu FISH je vhodná akákoľvek vzorka tkaniva alebo buniek.

V prenatálnej diagnostike to môžu byť odbery krvi, ejakulátu, príp.

Rýchlosť získania výsledkov je zabezpečená tým, že bunky získané z materiálu odobratého na analýzu nie je potrebné kultivovať v živných médiách, čím sa dosiahne ich rozdelenie na požadovaný počet, ako napr. klasickým spôsobom karyotypizácia.

Zvolený materiál je špeciálne pripravený na získanie koncentrovanej čistej bunkovej suspenzie. Ďalej sa uskutoční proces denaturácie DNA sondy a natívnej DNA testovanej vzorky do jednovláknového stavu a proces hybridizácie, počas ktorého sa zafarbené DNA sondy inkubujú s DNA vzorky.

Takto sa vizualizujú požadované (zafarbené) chromozómy v bunke, odhaduje sa ich počet, štruktúra genetických štruktúr atď. Okulár špeciálneho fluorescenčného mikroskopu vám umožňuje zvážiť svetelné reťazce DNA.

V súčasnosti je metóda FISH široko používaná na diagnostické účely na identifikáciu genetické choroby, chromozomálne aberácie v reprodukčnej medicíne, onkológii, hematológii, biologickej dozimetrii a pod.

Ako sa používa FISH-diagnostika plodu?

V oblasti reprodukčnej medicíny sa metóda FISH ako jedna z metód molekulárnej cytogenetickej diagnostiky využíva vo všetkých štádiách.

• pár.

Na určenie karyotypu budúcich rodičov sa vykonáva raz, pretože ľudský genóm sa počas života nemení.

Karyotypizácia páru pred počatím dieťaťa pomôže zistiť, či sú rodičia nositeľmi genetických patológií, ktoré sú dedičné, vrátane skrytých. A všeobecný stav genóm budúcich mamičiek a otcov, čo môže ovplyvniť úspešnosť počatia bábätka a nesenie tehotenstva.

Diagnostika FISH v tomto prípade často pôsobí ako dodatočné vyšetrenie na klasickú karyotypizáciu, pri zisťovaní chromozomálnych patológií v testovanom materiáli (venózna krv rodičov), ak je podozrenie na mozaikovitosť.

Doplňujúce vyšetrenie metódou FISH spoľahlivo potvrdí alebo vyvráti prítomnosť suspektnej anomálie v bunkách budúceho rodiča.

• Štúdium ejakulátu.

Je indikovaný pri ťažkostiach s reprodukciou v páre v dôsledku „mužského faktora“. Analýza spermy metódou FISH vám umožní posúdiť úroveň abnormálnosti chromozómová sada spermií, ako aj určiť, či je muž nosičom genetických chorôb spojených so sexom.

Ak sa pár neskôr uchýli k počatiu prostredníctvom IVF, analýza ejakulátu FISH vám umožní vybrať spermie najvyššej kvality na oplodnenie vajíčka.

• S IVF.

Na preimplantačnú genetickú diagnostiku (PGD). Podľa výsledkov štúdií karyotypu rodičov sa zisťujú možné chromozomálne a genetické aberácie, ktoré je možné preniesť na embryo.

Štúdium genetického zdravia výsledných embryí je vďaka možnostiam FISH diagnostiky možné uskutočniť v priebehu niekoľkých hodín pred transferom do dutiny maternice, aby sa zabezpečil nástup tehotenstva so známym zdravým plodom.

Možnosti PGD navyše umožňujú určiť pohlavie embryí, a teda v prípade potreby „objednať“ pohlavie nenarodeného dieťaťa.

• Počas obdobia tehotenstva.

V prenatálnej diagnostike: analýza fetálnych buniek získaných biopsiou choriových klkov, amniocentézou alebo kordocentézou metódou FISH, lekárske centrá zvyčajne ponúkajú okrem klasickej genetický výskum fetálnych buniek (karyotypizácia).

Táto metóda je nevyhnutná, keď je potrebné rýchlo získať odpoveď o prítomnosti najčastejších chromozómových chýb u plodu: trizómia na chromozómoch 21, 18, 13, aberácie na chromozómoch X a Y, niekedy aj aneuploidie na chromozómoch 14 (príp. 17), 15, 16.

Výhody analýzy FISH

Vykonávanie genetickej analýzy metódou FISH, hoci dnes zostáva pomocnou metódou na diagnostiku chromozomálnych patológií, účelnosť jej implementácie určuje nesporné výhody:

• rýchlosť získania výsledkov týkajúcich sa testovaných chromozómov - v priebehu niekoľkých hodín - nie viac ako 72.

To môže byť dôležité, ak osud tehotenstva závisí od diagnózy genetikov;

• vysoká citlivosť a spoľahlivosť metódy FISH – úspešná analýza je možná na zanedbateľne malom množstve biomateriálu – stačí jedna bunka, chyba výsledkov nie je väčšia ako 0,5 %.

To môže byť dôležité, keď je počet buniek v počiatočnej vzorke obmedzený, napríklad keď je ich delenie slabé.

• možnosť FISH diagnostiky v ktoromkoľvek štádiu tehotenstva (od 7. týždňa) a na akejkoľvek biologickej vzorke: fragmenty choria, plodová voda, krv plodu a pod.

Kde môžem získať diagnostiku FISH?

V Moskve sa metóda FISH na prenatálnu diagnostiku fetálnych chromozomálnych abnormalít používa v nasledujúcich zdravotníckych centrách:

Kliniky spravidla ponúkajú diagnostickú službu FISH v rámci kompletnej karyotypizácie plodu invazívnym zákrokom za príplatok. A budúci rodičia spravidla súhlasia, že si priplatia, pretože vďaka metóde FISH sa za pár dní dozviete to najdôležitejšie o svojom dieťatku.