Tradicionalna citogenetika pri proučevanju kariotipa je bil vedno omejen s pasovno stopnjo ločljivosti. Tudi z diferencialnim barvanjem kromosomov z visoko ločljivostjo smo našli samo več pasov na kromosom, vendar nismo bili prepričani, da smo dosegli molekularno raven ločljivosti. Najnovejši dosežki Tehnologije DNK in citogenetika so omogočile uporabo metod FISH za analizo sprememb v kromosomski DNK na molekularni ravni. Molekularna citogenetika je poskrbela za revolucionaren preboj v citogenetiki in omogočila:
Za analizo strukture DNK kromosomov v območju 10-100 kilobaz;
za diagnosticiranje nedeljivih interfaznih celic, kar je imelo velik vpliv na prenatalno diagnozo in predimplantacijsko genetsko diagnozo (PGD).
Tehnologija FISH uporablja sondo DNA, ki veže ali renaturira specifične sekvence DNA znotraj kromosoma. Denaturirana sonda se inkubira z nativno celično DNA, prav tako denaturirano v enoverižno stanje. Sonda nadomesti biotin deoksiuridin trifosfat ali digoksigenin uridin trifosfat s timidinom. Po renaturaciji naravne DNA s sondo lahko kompleks sonda-DNA zaznamo z dodajanjem avidina, ki veže biotin, označenega s fluorokromom, ali s fluorokromom označenega antidigoksigenina. Dodatno ojačanje signala lahko dosežemo z dodatkom antiavidina in pregledom nastalega kompleksa s fluorescenčno mikroskopijo. Z označevanjem različnih DNK sond z več različnimi fluorokromi lahko več kromosomov ali kromosomskih segmentov znotraj ene celice hkrati vizualiziramo kot večbarvne signale.
Sposobnost definiranja specifične genske segmente, prisoten ali odsoten na kromosomih, je omogočil diagnosticiranje sindromov genskih zaporedij na ravni DNK, kot tudi translokacij v interfaznih jedrih, pogosto v posameznih celicah.
material za RIBE lahko služi oz metafazni kromosomi izhajajo iz delečih se celic, ali interfazna jedra iz celic, ki niso v fazi delitve. Odrezki so predhodno obdelani z RNazo in proteinazo, da se odstrani RNK, ki bi lahko navzkrižno hibridizirala s sondo in kromatinom. Nato jih segrejemo v formamidu, da denaturiramo DNK, in fiksiramo z ledeno mrzlim alkoholom. Sondo nato s segrevanjem pripravimo za hibridizacijo. Nato se sonda in kromosomski pripravek zmešata in zapreta s pokrovom pri 37 °C za hibridizacijo. S spremembo inkubacijske temperature ali sestave soli hibridizacijske raztopine je mogoče povečati specifičnost vezave in zmanjšati označevanje ozadja.
Uporaba fluorescentne in situ hibridizacije - FISH tehnologija
Učinkovitost tehnologije FISH je bilo prvič dokazano z lokalizacijo genov na . Z uvedbo metode fluorescentnega označevanja je hibridizacija in situ postala nepogrešljiva za diagnozo kromosomskih nepravilnosti, ki jih ne zaznamo tradicionalne metode pasovanje. RIBE so imele tudi ključno vlogo pri enem najbolj nenavadnih odkritij sodobna genetika- genomski vtis.
Njegova razvojna tehnologija RIBE prejeli v treh oblikah. Za centromerne ali alfa-satelitne sonde je značilna relativna kromosomska specifičnost, najpogosteje so jih uporabljali v genetiki interfaznih celic. Te sonde ustvarjajo nekoliko razpršene signale ustrezne moči v regiji centromere, vendar se ne križajo s kromosomi, ki imajo podobna centromerna zaporedja. Trenutno so bile razvite sonde z eno kopijo, ki dajejo diskretni signal iz specifičnega kromosomskega pasu in omogočajo izogibanje pojavu navzkrižne hibridizacije. Te sonde je mogoče uporabiti tudi za določanje števila kopij in specifičnih kromosomskih regij, za katere sumimo, da so povezane z določenim sindromom. Enojne kopije in centromerne sonde, oblikovane za kromosome 13, 18, 21, X in Y, se uporabljajo za prenatalno diagnozo.
Z njim je mogoče "obarvati" tudi celotne kromosome RIBE. Zahvaljujoč tehnologiji spektralne kariotipizacije, ki uporablja mešanico različnih fluorokromov, je zdaj mogoče ustvariti edinstven fluorescenčni vzorec za vsak posamezni kromosom s 24 posameznimi barvami. Ta tehnologija omogoča določanje kompleksnih kromosomskih preureditev, ki niso vidne s tradicionalnimi citogenetskimi tehnikami.
Metoda RIBE v prenatalni diagnostiki. Za ženske v starejši rodni dobi je lahko nosečnost vzrok ne toliko za veselje, ampak zaskrbljujoč. S starostjo ženske je povezano tveganje za nastanek kromosomskih nepravilnosti ploda. Amniocenteza, opravljena v 16. tednu nosečnosti, nato analiza kariotipa traja 10-14 dni. Uporaba FISH v predpregledu omogoča hitrejšo diagnozo in krajše čakalne dobe. Večina genetikov in laboratorijev je mnenja, da metode FISH ne bi smeli uporabljati ločeno za odločanje o prihodnjem vodenju nosečnosti. Metodo FISH je treba dopolniti s kariotipsko analizo, njeni rezultati pa morajo vsaj korelirati s patološko sliko. ultrazvok(ultrazvok) ali biokemični pregled materine krvi.
Sindromi genov zaporedja znani tudi kot mikrodelecijski sindromi ali segmentna anevzomija. To so delecije sosednjih fragmentov kromosoma, ki običajno vključujejo veliko genov. Sindromi genskega zaporedja so bili prvič opisani leta 1986 s klasičnimi citogenetskimi tehnikami. Zdaj je zahvaljujoč FISH mogoče identificirati submikroskopske delecije na ravni DNK, kar je omogočilo identifikacijo najmanjše izbrisane regije, povezane z razvojem določenega sindroma, imenovane kritična regija. Ko je identificirana kritična regija za sindrom, je pogosto mogoče identificirati specifične gene, katerih odsotnost naj bi bila povezana s sindromom. Nedavni vodnik o sindromih zaporedja genov poroča o 18 sindromih izbrisov in mikrodelecij, povezanih s 14 kromosomi. Nekateri najpogostejši sindromi zaporedja genov in njihovi klinične manifestacije so podane v tabeli. 5-2.
Telomeri- tvorbe, ki pokrivajo konce dolgih in kratkih krakov kromosomov. Sestavljeni so iz ponavljajočih se sekvenc TTAGGG in preprečujejo zlitje koncev kromosomov. Telomerne sonde igrajo pomembno vlogo pri prepoznavanju kompleksnih translokacij, ki jih ni mogoče določiti s tradicionalnimi citogenetskimi metodami. Poleg tega je bilo eno od odkritij projekta človeškega genoma dejstvo, da so regije kromosomov, ki mejijo na telomere, bogate z geni. Zdaj je bilo dokazano, da so submikroskopske subtelomerne delecije odgovorne za pojav številnih genetsko pogojenih bolezni.
Določanje tumorskega statusa HER-2 z metodo FISH- preučevanje nagnjenosti k razvoju tumorja in izbira pravočasnega ustreznega zdravljenja raka dojke (BC) ali raka želodca (GC).
HER-2 (HER-2/neu)- receptor za človeški epidermalni rastni faktor-2 je protein, ki lahko vpliva na rast rakave celice. Ustvarja ga poseben gen, imenovan gen HER-2/neu. HER-2 je receptor za specifičen rastni faktor, imenovan humani epidermalni rastni faktor, ki se naravno pojavlja pri ljudeh. Ko se človeški epidermalni rastni faktor veže na receptorje HER-2 na celicah raka dojke, lahko spodbudi rast in delitev teh celic. V zdravem tkivu HER-2 prenaša signale, ki uravnavajo celično proliferacijo in preživetje, vendar lahko prekomerna ekspresija HER-2 povzroči maligno transformacijo celic.
Hiperekspresija HER-2 pri nekaterih podtipih raka dojke povzroči povečano proliferacijo in angiogenezo, disregulacijo apoptoze (gensko programirano samouničenje celic). Dokazano je, da je pri raku dojke prekomerna ekspresija tega receptorja v tumorskem tkivu povezana z bolj agresivnim potekom bolezni, povečanim metastatskim potencialom tumorja in manj ugodna prognoza. Odkritje povezave prekomerne ekspresije HER-2 s slabo prognozo raka dojke je pripeljalo do iskanja takšnih pristopov zdravljenja, ki so usmerjeni na specifično blokiranje onkogena HER-2/neu (ciljno zdravljenje proti HER2).
Rak dojke (BC) - maligni tumor žleznega tkiva mlečna žleza. RZhM zaseda prvo mesto med vsemi malignimi boleznimi pri ženskah.
Odvisno od prisotnosti bioloških označevalcev tumorja - izražanja hormonskih receptorjev (estrogena in / ali progesterona) izoliramo izražanje HER-2 - hormonsko-receptorsko-pozitivnega, HER-2-pozitivnega in trojno negativnega raka dojke.
Za HER-2/neu-pozitivne (HER-2+) vrste raka dojke je značilno visoko izražanje proteina HER-2/neu.
Za HER=2/neu-negativne (HER-2-) vrste raka dojke je značilno nizko izražanje ali odsotnost proteina HER-2/neu.
Ocenjuje se, da je ena od petih žensk z rakom dojke pozitivna na HER-2. Večina rakov dojk je hormonsko odvisnih: estrogeni in progesteron nanje delujejo stimulativno (proliferativno in neoplastično). Pri HER-2 pozitivnem raku dojke je na površini tumorskih celic prisoten presežek receptorjev HER-2. Ta pojav se imenuje "pozitiven status HER-2" in je diagnosticiran pri 15-20% žensk z rakom dojke.
NJENA-2- receptor za človeški epidermalni rastni faktor tipa 2, ki je normalno prisoten v tkivih in sodeluje pri regulaciji celične delitve in diferenciacije. Njegov presežek na površini tumorskih celic (hiperekspresija) določa hitro nenadzorovano rast neoplazme, visoko tveganje za metastaze in nizko učinkovitost nekaterih vrst zdravljenja. HER-2 pozitivni rak dojke je posebej agresivna oblika ta bolezen, Zato natančna definicija Status HER-2 je ključnega pomena za izbiro taktike zdravljenja.
Rak želodca (SC)- maligni tumor, ki izvira iz epitelija želodčne sluznice.
Rak želodca je na 4. mestu v strukturi onkološke obolevnosti in na 2. mestu v strukturi onkološke umrljivosti v svetu. Incidenca raka želodca pri moških je 2-krat večja kot pri ženskah. Rusija spada med regije z visoko pojavnostjo raka želodca in smrtnostjo zaradi te bolezni. Diagnoza gastroezofagealne zgodnje faze težko zaradi dolgega asimptomatskega poteka bolezni. Pogosto se rak želodca odkrije v kasnejših fazah, ko 5-letna stopnja preživetja ne presega 5-10%, kemoterapija pa ostaja edino zdravljenje.
Glavna metoda zdravljenja raka želodca je kirurška. Vendar pa pri večini bolnikov ob diagnozi ugotovimo razširjen tumorski proces, ki onemogoča izvedbo radikalne operacije in zahteva sistemsko zdravljenje z zdravili. Izvajanje kemoterapije statistično pomembno poveča celotno preživetje bolnikov z metastatskim rakom želodca in izboljša kakovost njihovega življenja.
Onkogen HER-2 (erbB-2) je bil prvotno identificiran v tumorjih dojke. Pomnoževanje in prekomerna ekspresija tega gena je relativno specifičen dogodek za karcinom dojke in se praktično ne pojavi pri tumorjih drugih lokalizacij. Zdi se, da je rak želodca ena redkih izjem: aktivacijo HER-2 opazimo v približno 10-15 % primerov. maligne neoplazme tega organa in je v korelaciji z agresivnim potekom bolezni.
Prekomerna ekspresija HER-2 je slab prognostični dejavnik. Glede na različne študije je povečanje gena HER-2 pri bolnikih z rakom želodca povezano z nizkimi skupnimi stopnjami preživetja.
Metoda FISH se uporablja za oceno stanja HER-2 pri GC in BC.
RIBE- raziskave vam omogočajo, da določite kvalitativne in kvantitativne spremembe v kromosomih za diagnozo malignih krvnih bolezni in solidnih tumorjev.
Danes se študije FISH pogosto uporabljajo po vsem svetu.
Metoda FISH (fluorescentna hibridizacija in situ) - študija števila HER-2/neu-genov znotraj rakavih celic.
Indikacije:
- rak dojke - za namene prognoze in izbire terapije;
- rak želodca - za namene prognoze in izbire terapije.
Določi lečeči zdravnik.
Potreben je histološki protokol in imunohistokemijski protokol, IHC steklo.
Interpretacija rezultatov
Rezultati testa FISH so izraženi na naslednji način:
1. Pozitivno (povečana vsebnost, pride do ojačanja gena HER-2):
- HER-2 pozitivni rak dojke;
- HER-2 negativni rak dojke.
Rak dojke - nevarna bolezen, ki je po statističnih podatkih na prvem mestu med rakavimi obolenji pri ženskah. Tveganje za razvoj te bolezni se poveča pri vseh ženskah, starejših od 40 let, in je lahko posledica številnih drugih dejavnikov. Med najverjetnejše vzroke za nastanek raka dojke so debelost, genetska ali dedna nagnjenost, zgodnji začetek menstruacije in njihovega poznega zaključka, hormonske ali radioterapije.
Poleg tega je tveganje za obolevnost povečano pri nosečnicah in ženskah, ki so že prebolele raka. Tudi moški lahko zbolijo za rakom dojke.
Vrste in metode diagnoze
Prvi korak pri diagnosticiranju raka dojke je rutinski pregled pri mamologu. Ženske, starejše od 40 let, morajo te preglede opraviti vsaj enkrat na dve leti. Zdravnik opravi vizualni pregled, palpacijo in mamografijo mlečnih žlez. Vizualni znaki razvoja bolezni so lahko:
splošne informacije
Rentgenski pregled dojk (mamografija) vam omogoča, da ugotovite prisotnost, velikost in lokacijo tumorja. Za izboljšanje natančnosti dobljenih rezultatov se uporablja tehnologija uvajanja kontrastnega sredstva. Če je tumor že odkrit, se uporabi metoda pnevmocistografije - odstranitev tumorske tekočine in vnos zraka v votlino. Če prisotnost tumorja ni določena, se uporablja duktografija - vnos kontrastnega sredstva v mlečne kanale.
Te metode vam omogočajo vizualizacijo prisotnosti formacij v tkivih mlečne žleze.
Če je prisotnost tumorja razvidna tudi na mamografiji, se bolnica napoti na sklop diagnostičnih ukrepov:
Na ultrazvoku lahko zdravnik loči tumor od ciste in razjasni lokalizacijo tvorbe. Po tem se iz njega vzame vzorec tkiva za biopsijo. Biopsija vam omogoča, da ugotovite vrsto tvorbe: benigno ali maligno, pa tudi ugotovite, ali je tumor hormonsko odvisen. Ti podatki omogočajo zdravniku, da se odloči o strategiji zdravljenja, vendar ne omogoča vedno določitve stopnje. Pogosto tudi z vsemi potrebnimi diagnostične dejavnosti lahko se določi šele po operaciji.
Mehanizem histoloških študij
Biopsija tkiva se opravi pred operacijo in po njej. Postopek se izvede po razjasnitvi lokalizacije izobraževanja.
Biopsija je postopek odstranitve koščka tkiva, njegova študija pa se imenuje "histološki pregled" ali preprosto "histologija".
Zdravstveni delavec s posebno iglo vzame majhno količino tkiva iz neoplazme ali pa se tumor, ki je že odstranjen iz bolnikovega telesa, pošlje na histološko preiskavo. Nato se fragment tkiva obarva in obdela na poseben način, da se poveča kontrast in olajša preučevanje. Rezino pod mikroskopom pregleda specialist in poda sklep o kakovosti tumorske tvorbe. Veliko v tej študiji je odvisno od pozornosti in usposobljenosti laboratorijskega pomočnika, ki daje zaključek.
Sorodna študija je imunohistokemija. Na splošno se lahko imenuje tudi "histologija", ker. metoda temelji na preučevanju tkiv, vendar je imunohistokemija naprednejša metoda analize. Tkivo v tej študiji je tudi obarvano s posebnimi reagenti, ki ne samo povečajo vizualni kontrast, temveč tudi kombinirajo (»označijo«) s protitelesi na poseben način, kar omogoča določitev več značilnosti neoplazme. Reakcija v tem primeru poteka veliko hitreje, kar vam omogoča hitro pridobivanje rezultatov analize.
Imunohistokemija omogoča ne samo razjasnitev vrste neoplazme, temveč tudi načrtovanje strategije zdravljenja bolnika na podlagi odkrivanja občutljivosti tumorskega tkiva na različne vrste terapevtski učinek. Poleg tega je izvajanje te študije čim bolj avtomatizirano, kar zmanjšuje verjetnost diagnostične napake zaradi človeškega dejavnika.
Obstajajo tudi sodobni diagnostični ukrepi, ki omogočajo odkrivanje prisotnosti tumorja v telesu: to je spektralna analiza krvi, imunološka (biokemijska) analiza, FISH test tumorskega tkiva. Genetski krvni test omogoča vsaki ženski, da preveri prisotnost ali odsotnost predpogojev za nastanek raka dojke. CT in MRI vam omogočata, da natančno določite lokalizacijo tumorja in izsledite dinamiko njegovega razvoja, ocenite strukturo neoplazme.
Kako odkriti raka s krvnim testom?
Krvni test v glavnem predpiše zdravnik po ultrazvočnem pregledu. Obstajajo situacije, ko bolnik lastno pobudo daruje kri za označevalce oken ali genetsko analizo, da bi ugotovili, ali so nagnjeni k raku dojke. V nekaterih primerih splošna analiza kri lahko služi kot razlog za stik z onkološkim dispanzerjem (skupaj s palpacijo pečata ali vidnimi znaki raka).
Biokemična analiza
Kri kot material za raziskave omogoča naslednje diagnostične ukrepe:
Hkrati lahko le prvi dve analizi imenujemo specializirani metodi za odkrivanje raka, od katerih je druga bolj preventivni ukrep kot operativni. Dva druga krvna testa se opravita predvsem pred operacijo, da se ugotovi stanje telesa in obseg procesa. Vendar, kot je bilo že omenjeno, če se v prsih čuti pečat in hkrati splošni krvni test pokaže več kot dva negativna diagnostična koeficienta, je to razlog za stik s specialistom. Negativni koeficienti so kazalniki zunaj norme pri določenih parametrih sestave krvi.
Biokemični krvni test razkriva prisotnost protiteles proti tumorskim celicam. Takšna telesa se imenujejo tumorski markerji. Število in vrsta tumorskih markerjev je odvisno od specifike (lokalizacije) rakavi tumor in stopnje njegovega razvoja. Tumorski markerji vključujejo:
Pri raku dojk bo lečečega zdravnika zanimala predvsem prisotnost tumorskega markerja CA-15-3, saj njegova prisotnost v krvi nedvoumno kaže na bolezen raka dojke. Dešifriranje rezultata traja v povprečju en dan. Biokemična analiza se izvaja večkrat med potekom bolezni. Kri zanj se vzame iz vene zjutraj na prazen želodec. Dva tedna pred testom bolnik preneha jemati vse zdravila(določi lečeči zdravnik). Dva dni pred darovanjem krvi ne morete jesti alkohola, mastne in ocvrte hrane.
Eno uro pred postopkom ne morete kaditi in je zaželeno zmanjšati čustveni stres. Kri na biokemična analiza običajno ne odnehajo takoj po obsevanju in fizioterapiji.
Opredelitev genetskih dejavnikov
Preden govorimo o genetskem krvnem testu, je treba poudariti razliko med pojmoma "genetsko" in "dedno". genetski dejavnik Pojav raka je širši pojem, ki ne pomeni le prisotnosti sorodnikov z rakom dojke, temveč tudi specifično gensko mutacijo, zaradi katere se poveča tveganje za to bolezen.
Dedni dejavnik pomeni potencialno tveganje za raka dojke na podlagi družinske anamneze. Hkrati lahko ne le ženske, ampak tudi moški dobijo mutirani gen, vendar njegov nosilec ne bo nujno zbolel.
Vsaka ženska lahko opravi genetsko analizo. To je še posebej priporočljivo za tiste, katerih neposredni sorodniki so imeli raka dojke. Pred postopkom darovanja krvi za analizo se mora s pacientom pogovoriti specialist s področja genetike, ki bo razložil nianse dešifriranja rezultatov. Od bolnika pred darovanjem krvi ni potrebna posebna priprava.
V primeru prejema pozitiven rezultat mutacije v genih BRCA, vendar v odsotnosti drugih simptomi anksioznosti, ni panike. Ženskam z mutacijo teh genov se lahko kot preventivni ukrep priporočajo redni samopregledi in fizični pregledi. Po 40 letih je smiselno razmišljati o odstranitvi jajčnikov in dojk, mlajšim ženskam, ki v prihodnosti ne nameravajo imeti otrok, se včasih priporoča jemanje kontracepcijskih sredstev. Odločitev o teh ukrepih je v celoti na ramenih ženske same in zahteva premišljen pristop in posvetovanje z zdravniki.
Najnovejše diagnostične metode
Spektralna analiza kri razkriva prisotnost neoplazem v telesu z verjetnostjo do 93%. To je relativno poceni diagnostična metoda, ki temelji na infrardečem obsevanju krvnega seruma in analizi njegove molekularne sestave.
Zaključek o spektralni analizi krvi je podan po načelu "prisotnosti-odsotnosti" in je namenjen identifikaciji večine vrst malignih tumorjev. Tudi ta študija lahko določi stopnjo razvoja raka dojke. Interpretacija rezultatov poteka v laboratoriju in ne zahteva dodatnega zdravnikovega mnenja.
Za darovanje krvi za spektralno analizo je potrebno dokončati jemanje zdravil 2 meseca pred posegom. Od trenutka rentgenske ali druge izpostavljenosti, pa tudi kemoterapije, morajo miniti vsaj 3 meseci. Poleg tega ženska v času odvzema krvi ne sme biti noseča ali imeti menstruacijo. Vzorčenje krvi poteka zjutraj na prazen želodec. Spektralna analiza krvi v povprečju traja 12 delovnih dni.
Eden od najnovejše metode diagnostika raka je tako imenovani "ribji test" (FISH, fluorescentna hibridizacija). O njegovi učinkovitosti se še vedno razpravlja, glavno vprašanje njene izvedljivosti pa je drag raziskovalni postopek. Bistvo metode je označevanje celičnih fragmentov s fluorescentno sestavo in nadaljnji mikroskopski pregled celic. Glede na to, s katerimi deli genetskega materiala so bili označeni fragmenti v stiku, je mogoče razumeti, ali ima bolnik nagnjenost k raku in kakšne metode zdravljenja bodo v posameznem primeru pomembne.
Test FISH ne zahteva popolnoma zrelih celic, zato je ta analiza veliko hitrejša od drugih laboratorijskih testov. Poleg tega vam metoda FISH omogoča bolj jasno opazovanje genetskih poškodb, kar z drugimi vrstami analiz ni mogoče. Test FISH se najpogosteje uporablja prav za odkrivanje raka dojke, deluje pa tudi pri odkrivanju nekaterih drugih vrst raka.
Slabosti testa FISH so poleg visokih stroškov tudi nezmožnost delovanja na nekaterih delih kromosomov zaradi specifičnosti oznak. Poleg tega test FISH ne upošteva določenih vrst mutacij in okvar. genetski kod, kar je lahko pomembna pomanjkljivost pri diagnozi. Primerjalna Študije FISH s cenejšim testom IHC ni pokazala pomembnih prednosti pri določanju občutljivosti rakavih celic na herceptin. Kljub temu je test FISH trenutno najhitrejši med visoko natančnimi metodami za diagnosticiranje raka.
RIBA je eno najbolj neverjetnih "orodij" molekularna biologija XXI stoletje. V predimplantacijski diagnostiki se raziskovalna tehnika FISH uporablja za odkrivanje kromosomskih nenormalnosti ali motenj kromosomskega parjenja v celicah zarodka, ki je bil pravkar pridobljen z in vitro oploditvijo (IVF). Če ne najdemo nobenih anomalij ali znakov anevploidije (motnje parjenja, pomanjkanje kromosomskih parov), se "umetni" zarodek šteje za sposobnega preživetja. Lahko se vsadi v maternico bodoče matere.
FISH omogoča tudi sledenje spolnim značilnostim v kromosomskem nizu zarodka. To omogoča določitev spola nerojenega otroka še pred dejanskim nastopom nosečnosti (če štejemo, da gre za začetek vgnezditve zunajtelesno spočetega zarodka v maternico).
Kaj je FISH?
Okrajšava pomeni: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ali fluorescentna in-situ hibridizacija. Zapis nevednemu bralcu najverjetneje ne pove ničesar. Zato bomo analizirali kompleksen koncept po delih, neprevedeno »in-situ« pustimo za konec.
Hibridizacija
V molekularni biologiji ima ta izraz prav poseben pomen, ki nima nobene zveze s križanjem vrst v »navadni« biologiji.
Hibridizacija je molekularna genetska tehnika, ki se uporablja za oceno stanja DNA in RNA proučevanih celic. Temelji na povezovanju posameznih verig nukleinskih kislin v eno samo molekulo. Tako se preveri komplementarnost (medsebojno ujemanje) molekul ali njihovih fragmentov drug drugemu. Ob popolni komplementarnosti se verige enostavno in hitro povežejo v skupno molekulo. Počasno povezovanje kaže na nezadostno komplementarnost. Nekomplementarnost verig je ravno zaradi kromosomskih nepravilnosti (kršitve v vrstnem redu razporeditve kromosomov na določenih območjih), neparnih kromosomov ali odsotnosti nekaterih parov.
»Orodje« za merjenje komplementarnosti je temperatura, pri kateri se verige DNK hibridizirajo v skupno molekulo. Za to morate pripravek nukleinske kisline najprej segreti, nato pa ga po mešanju z drugim segretim pripravkom ohladiti. Pri segrevanju vodikove vezi med verigami DNA ali RNA izginejo, nastanejo enoverižni fragmenti molekul. Mešani pripravki dveh DNA ali RNA (ali DNA - RNA) se ohladijo. Pri ohlajanju se vodikove vezi med komplementarnimi bazami hitro obnovijo, nastane ena sama, hibridna molekula DNA (RNA ali DNA - RNA). Pri pomanjkanju komplementarnosti proces traja dlje, nekomplementarni delci ostanejo nepritrjeni. Zato je višja kot je temperatura hibridizacije, bolj harmonična in pravilna je kromosomska struktura celic. Nižja kot je temperatura, več je nepravilnosti v kromosomih. Na podlagi analize nekomplementarnih ostankov je mogoče identificirati specifične anomalije ali področja anevploidije.
Fluorescentno označevanje
Za analizo komplementarnosti hibridizirajoče molekule DNA (ali RNA) se uporabljajo posebne genetske sonde (ali DNA sonde), ki pa seveda nimajo veliko skupnega s svojimi soimenjaki, ki se uporabljajo na primer v kirurgiji.
Genetske sonde so sintetizirane in posebej označene enoverižne DNA (redko RNA) z vnaprej določenimi lastnostmi komplementarnosti. Pri hibridizaciji se združijo z določenimi genetskimi fragmenti in tako potrdijo svojo komplementarnost. Lokacija sond v hibridizirani molekuli kaže na normalno ali okvarjeno strukturo prvotnega kromosomskega materiala, iz katerega je sestavljena ta "umetna struktura".
Genetske sonde so označene predvsem s svetlečimi (fluorescentnimi) snovmi, zaradi česar so vidne pod lečo posebnega fluorescenčnega mikroskopa.
Uporaba različnih barvil za več sond omogoča hkratno analizo različnih genetskih struktur, na primer za identifikacijo kromosomskih regij z dvema genoma, ki sta nameščena drug na drugega, in drugih anomalij.
Trenutno se pri izvajanju posamezne analize genetske sonde označi s petimi ali šestimi različnimi barvili, včasih tudi s sedmimi.
In-situ pomeni "doma"
Prvotna tehnika hibridizacije je bila okorna. Ekstrahirano DNA smo denaturirali v posebnih termičnih pufrih, zmešali v centrifugi z drugimi denaturiranimi fragmenti. Hibridizacija je bila izvedena tudi v laboratoriju, »v kemični stekleni posodi«.
Sodobna tehnologija omogoča izvajanje analiz in situ, torej »na licu mesta«, »doma«, v originalnih genetskih strukturah in ne v laboratorijsko izdelanih pripravkih. Predmet proučevanja so bila sama celična jedra (polarna telesca, blastomere, površinske celice blastociste, ekstrahirane med biopsijo).
Opazovanje genetskega materiala neposredno v jedru celice pospeši proces, ga naredi bolj »čistega«, brez zunanjih vplivov in poškodb, ki pri izdelavi laboratorijskih pripravkov niso izključene.
So pa težave, ki kažejo na nepremostljive meje. ta metoda. Ena sama hibridizacija ne more »pokriti« celotnega nabora kromosomov v celicah. Običajno sta potrebni dve ali tri zaporedne hibridizacije, ki omogočajo preučevanje 12-15 kromosomskih parov (in jih je pri ljudeh 23). Sposobnost nadaljnje hibridizacije v verigah DNA po vsaki rehibridizaciji postopoma upada. To ne dovoljuje hibridizacije "kolikorkrat želite" za izčrpno analizo istega genskega materiala.
Invazivne metode prenatalne diagnoze omogočajo ne samo pogled v prihodnost in zanesljivo napovedovanje, ali nerojeni otrok še vedno pričakuje bolezni, povezane z intrauterinimi malformacijami, temveč tudi odkrivanje narave in vzrokov prirojenih patologij.
Vsaka informacija pa je dragocena le takrat, ko je pravočasna. če pogovarjamo se o stanju razvoja ploda je ključnega pomena hitrost pridobivanja rezultatov testa.
Zato je metoda FISH, ki omogoča oceno prisotnosti najpogostejših razvojnih nepravilnosti pri zarodku v največji možni meri. kratek čas, je zelo zahtevan v genetski diagnostiki.
FISH je okrajšava, ki razvozlava bistvo tehnologije za odkrivanje kromosomskih nepravilnosti – fluorescence in situ hybridization – fluorescenčna hibridizacija v »domačem« okolju.
Ta tehnika, ki sta jo v poznih 70. letih prejšnjega stoletja predlagala J. Goll in M.-L. Pardew temelji na možnosti ponovne vzpostavitve zaporedja fragmentov nukleinske kisline (DNA ali RNA) po njihovi denaturaciji.
Avtorji so razvili metodo, ki omogoča in situ hibridizacijo umetno ustvarjenih označenih DNA sond (sond) in citogenetskega materiala, odvzetega za analizo, identifikacijo kvantitativnih in kvalitativna odstopanja zanimivih kromosomov.
Konec prejšnjega stoletja, po uspešni uporabi fluorescentnih barvil za barvanje DNA sond, je metoda FISH dobila ime in se od takrat intenzivno izpopolnjuje in spreminja.
Sodobne metode FISH-analize težijo k temu, da bi v enem samem hibridizacijskem postopku pridobili čim bolj popolne informacije za analizo zbranega genskega materiala.
Dejstvo je, da je mogoče enkrat po hibridizaciji ovrednotiti le omejeno število kromosomov istega citogenetskega materiala. Sposobnost ponovne hibridizacije verig DNK se od časa do časa zmanjša.
Zato se trenutno v genetski diagnostiki najpogosteje uporablja metoda in situ hibridizacije za hiter odgovor na vprašanja o najpogostejših anevploidijah za kromosome 21, 13, 18, pa tudi za spolne kromosome X, Y.
Vsak vzorec tkiva ali celice je primeren za analizo FISH.
Pri prenatalni diagnostiki so to lahko vzorci krvi, ejakulata oz.
Hitrost pridobivanja rezultatov je zagotovljena z dejstvom, da celic, pridobljenih iz materiala, odvzetega za analizo, ni treba gojiti v hranilnih medijih, doseči njihovo delitev na želeno število, kot v klasičen način kariotipizacija.
Izbrani material je posebej pripravljen za pridobitev koncentrirane čiste celične suspenzije. Nato se izvede proces denaturacije vzorca DNK in nativne DNK testnega vzorca v enoverižno stanje ter postopek hibridizacije, med katerim se obarvane DNK sonde inkubirajo z DNK vzorca.
Tako se vizualizirajo želeni (obarvani) kromosomi v celici, oceni njihovo število, zgradba genetskih struktur itd. Okular posebnega fluorescentnega mikroskopa omogoča opazovanje svetlečih verig DNK.
Trenutno se metoda FISH pogosto uporablja za diagnostične namene za identifikacijo genetske bolezni, kromosomske aberacije v reproduktivni medicini, onkologiji, hematologiji, biološki dozimetriji itd.
Kako se uporablja FISH-diagnoza ploda?
Na področju reproduktivne medicine se metoda FISH kot ena izmed metod molekularne citogenetske diagnostike uporablja v vseh fazah.
- par.
Za določitev kariotipa bodočih staršev se izvede enkrat, saj je človeški genom skozi vse življenje nespremenjen.
Kariotipizacija para pred spočetjem otroka bo pomagala ugotoviti, ali so starši nosilci genetskih patologij, ki so podedovane, vključno s skritimi. in splošno stanje genom bodočih mater in očetov, kar lahko vpliva na uspešnost spočetja otroka in nosečnosti.
Diagnostika FISH v tem primeru pogosto deluje kot dodatni pregled na klasično kariotipizacijo, ko se v testnem materialu odkrijejo kromosomske patologije (venska kri staršev), če obstaja sum na mozaizem.
Dodaten pregled z metodo FISH bo zanesljivo potrdil ali ovrgel prisotnost domnevne anomalije v celicah bodočega starša.
- Študija ejakulata.
Indiciran je pri težavah z razmnoževanjem v paru zaradi »moškega faktorja«. Analiza semena po metodi FISH vam bo omogočila oceno stopnje nenormalnosti kromosomski nabor semenčic, pa tudi za ugotavljanje, ali je moški nosilec genskih bolezni, povezanih s spolom.
Če se par pozneje odloči za spočetje z IVF, vam bo FISH analiza ejakulata omogočila izbiro najkakovostnejše sperme za oploditev jajčeca.
- Z IVF.
Za predimplantacijsko genetsko diagnozo (PGD). Glede na rezultate študij kariotipa staršev se določijo možne kromosomske in genetske aberacije, ki se lahko prenesejo na zarodek.
Zahvaljujoč zmožnostim diagnostike FISH se lahko študija genetskega zdravja nastalih zarodkov izvede v nekaj urah pred prenosom v maternično votlino, da se zagotovi začetek nosečnosti z znanim zdravim plodom.
Poleg tega možnosti PGD omogočajo določitev spola zarodkov in posledično "naročanje" spola nerojenega otroka, če je to potrebno.
- V obdobju brejosti.
V prenatalni diagnostiki: analizo fetalnih celic, pridobljenih z biopsijo horionskih resic, amniocentezo ali kordocentezo po metodi FISH, zdravstveni centri običajno ponujajo poleg klasične genetske raziskave fetalne celice (kariotipizacija).
Ta metoda je nepogrešljiva, ko je treba hitro dobiti odgovor o prisotnosti najpogostejših kromosomskih napak pri plodu: trisomije na kromosomih 21, 18, 13, aberacije na kromosomih X in Y, včasih tudi anevploidije na kromosomih 14 (oz. 17), 15, 16.
Prednosti analize FISH
Izvajanje genetske analize po metodi FISH, čeprav danes ostaja pomožna metoda za diagnosticiranje kromosomskih patologij, pa smotrnost njegovega izvajanja določa nedvomne prednosti:
- hitrost pridobivanja rezultatov glede testiranih kromosomov - v nekaj urah - ne več kot 72.
To je lahko pomembno, če je usoda nosečnosti odvisna od diagnoze genetikov;
- visoka občutljivost in zanesljivost metode FISH–uspešna analiza je možna na zanemarljivo majhni količini biomateriala – zadostuje ena celica, napaka rezultatov ni večja od 0,5%.
To je lahko pomembno, kadar je število celic v začetnem vzorcu omejeno, na primer, ko je njihova delitev slaba.
- možnost FISH diagnostike v kateri koli fazi nosečnosti (od 7. tedna) in na kateremkoli biološkem vzorcu: delci horiona, amnijska tekočina, fetalna kri itd.
Kje lahko dobim diagnostiko FISH?
V Moskvi se metoda FISH za prenatalno diagnozo fetalnih kromosomskih nepravilnosti uporablja v naslednjih zdravstvenih centrih:
Klinike praviloma proti doplačilu ponujajo storitev diagnostike FISH v sklopu popolne kariotipizacije ploda z invazivnim posegom. In praviloma se bodoči starši strinjajo z doplačilom, saj lahko zahvaljujoč metodi FISH v nekaj dneh izveste najpomembnejše o vašem otroku.
