Punkcija regionalnih limfnih čvorova
Koža iznad limfnih čvorova tretira se 96% alkoholom i 3-5% alkoholnom otopinom joda. Zatim 1 i 2 prsta lijeve ruke fiksirajte limfni čvor. Desna ruka uzmite sterilnu štrcaljku s nekoliko kapi izotonične otopine natrijevog klorida koja se ubrizgava paralelno uzdužna os limfni čvor. Igla se gura u različitim smjerovima do suprotne stijenke kapsule čvora i polako se ubrizgava sadržaj štrcaljke. Prstima lijeve ruke lagano se masira limfni čvor. S polaganim izvlačenjem igle, klip štrcaljke se istovremeno pomiče napred, aspirirajući sadržaj limfnog čvora. Materijal se nanese na predmetno staklo (uz malu količinu materijala doda se kap izotonične otopine natrijevog klorida), prekrije pokrovnim staklom. Proučavanje nativnog lijeka provodi se u tamnom vidnom polju pomoću svjetlosno-optičkog mikroskopa sa kondenzatorom tamnog polja (objektiv 40, 7x, 10x ili 15x). Blijede treponeme mogu se naći i u obojenim preparatima. Kada se boje prema Romanovsky-Giemsi, blijede treponeme su obojene ružičasto, prema Fontanu i Morozovu u smeđu (crnu), prema metodi Burri, neobojene treponeme se otkrivaju na tamnoj pozadini.Serološka dijagnostika
Značaj u dijagnosticiranju sifilisa, procjeni učinkovitosti liječenja, utvrđivanju kriterija izlječenja, prepoznavanju skrivenih, rezistentni oblici vezane uz standardne (klasične) i specifične serološke reakcije. Standardni ili klasični serološki testovi (SSR) uključuju:- Wassermanova reakcija (RV),
- sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog (citoholna),
- reakcija na staklo (ekspresna metoda),
- reakcija imobilizacije blijede treponeme (RIBT),
- reakcija imunofluorescencije (RIF).
Wassermanova reakcija (RV)
- razvio A. Wasserman zajedno s A. Neisserom i C. Bruckom 1906. godine. Wassermanova reakcija temelji se na fenomenu fiksacije komplementa (Borde-Ganguova reakcija) i omogućuje određivanje antilipidnih protutijela (reagina). Prema moderne ideje, u Wassermanovoj reakciji utvrđuju se antitijela na lipide makroorganizama, a ne na blijedu treponemu, a reakcija otkriva autoimuni proces koji je uzrokovan denaturacijom tkiva makroorganizma od strane blijede treponeme uz stvaranje lipoproteinskog kompleksa (konjugata), u kojem lipidi (hapteni) su odrednica.Obično se RV postavlja s dva ili tri antigena. Najčešće se koriste visoko osjetljivi kardiolipinski antigen (ekstrakt goveđeg srca obogaćen kolesterolom i lecitinom) i treponemski antigen (sonicirana suspenzija anatogeno uzgojene treponeme pallidum). Zajedno s reaginima krvnog seruma bolesnika, ti antigeni tvore imunološki kompleks sposoban adsorbirati i vezati komplement. Za vizualno određivanje formiranog kompleksa (reagini + antigen + komplement) kao indikator se koristi hemolitički sustav (mješavina eritrocita ovna s hemolitičkim serumom). Ako se u 1. fazi reakcije veže komplement (reagini + antigen + komplement) ne dolazi do hemolize - eritrociti se talože u lako uočljiv precipitat (PB pozitivni). Ako se komplement ne veže u fazi 1 zbog odsutnosti reagina u ispitivanom serumu, hemolitički sustav će ga iskoristiti i doći će do hemolize (PB negativan). Stupanj ozbiljnosti hemolize u postavljanju RV procjenjuje se plusima: potpuna odsutnost hemolize ++++ ili 4+ (RV oštro pozitivan); jedva započeta hemoliza +++ ili 3+ (PB pozitivan); značajna hemoliza ++ ili 2+ (PB slabo pozitivan); nerazumljiva slika hemolize ± (DV sumnjiv); potpuna hemoliza - (Wassermannova reakcija je negativna).
Osim kvalitativne procjene RV postoji i kvantitativna formulacija s različitim razrjeđenjima seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titar reagina određen je maksimalnim razrjeđenjem, koje ipak daje oštro pozitivan (4+) rezultat. Kvantitativna formulacija RV važna je u dijagnostici nekih kliničkih oblika sifilitičke infekcije, kao i u praćenju učinkovitosti liječenja. Trenutno se Wassermanova reakcija postavlja s dva antigena (kardiolipin i treponemal sondirani Reiter soj). U pravilu, RV postaje pozitivan 5-6 tjedana nakon infekcije u 25-60% pacijenata, 7-8 tjedana - u 75-96%, 9-19 tjedana - u 100%, iako u posljednjih godina ponekad prije ili kasnije. Istodobno, titar reagina postupno raste i doseže maksimalnu vrijednost (1: 160-1: 320 i više) u slučaju pojave generaliziranih osipa (sekundarni svježi sifilis). Kada je RV pozitivan, postavlja se dijagnoza primarnog seropozitivnog sifilisa.
Sa sekundarnim svježim i sekundarnog rekurentnog sifilisa, RV je pozitivan u 100% pacijenata, ali se negativan rezultat može primijetiti u imunokompromitiranih pothranjenih pacijenata. Zatim se titar reagina postupno smanjuje i kod sekundarnog rekurentnog sifilisa obično ne prelazi 1:80-1:120.
S tercijarnim sifilisom RV je pozitivan u 65-70% bolesnika i obično se opaža nizak titar reagina (1:20-1:40). S kasnim oblicima sifilisa (sifilis unutarnji organi, živčani sustav) pozitivan RV se opaža u 50-80% slučajeva. Titar reagina kreće se od 1:5 do 1:320.
S latentnim sifilisom pozitivan RV se opaža u 100% pacijenata. Titar reagina je od 1:80 do 1:640, a kod kasnog latentnog sifilisa od 1:10 do 1:20. Brzo smanjenje titra reagina (do potpune negativnosti) tijekom liječenja ukazuje na učinkovitost liječenja.
Nedostaci Wassermannove reakcije- nedostatak osjetljivosti početno stanje primarni sifilis je negativan). Također je negativan u 1/3 bolesnika, ako su u prošlosti bili liječeni antibioticima, u bolesnika s tercijarnim aktivnim sifilisom s lezijama kože i sluznica, koštano-zglobnog aparata, unutarnjih organa, središnjeg živčanog sustava, s kasnim kongenitalnim sifilisom .
Nedostatak specifičnosti- Wassermanova reakcija može biti pozitivna kod osoba koje prethodno nisu bile bolesne i ne boluju od sifilisa. Konkretno, lažno pozitivni (nespecifični) rezultati RV uočeni su kod pacijenata koji boluju od sistemskog eritemskog lupusa, lepre, malarije, malignih neoplazmi, oštećenja jetre, opsežnih infarkta miokarda i drugih bolesti, a ponekad i kod potpuno zdravih ljudi.
Otkriva se kratkotrajna lažno pozitivna Wassermanova reakcija kod nekih žena prije ili poslije poroda, kod osoba koje zlorabe droge, nakon anestezije, uzimanja alkohola. U pravilu je lažno pozitivan RV slabo izražen, često s niskim titrom reagina (1:5-1:20), pozitivan (3+) ili slabo pozitivan (2+). Kod masovnih seroloških pretraga učestalost lažno pozitivnih rezultata je 0,1-0,15%. Za prevladavanje nedostatka osjetljivosti koriste postavljanje na hladno (Collardova reakcija), a istodobno se postavlja s drugim serološkim reakcijama.
Sedimentne reakcije Kahna i Sachs-Vitebskog
Wassermanova reakcija koristi se u kombinaciji s dvije sedimentne reakcije (Kahn i Zaks-Vitebsky), tijekom čije proizvodnje se pripremaju koncentriraniji antigeni. Ekspresna metoda (mikroreakcija na staklu) - odnosi se na lipidne reakcije i temelji se na reakciji taloženja. Stavlja se sa specifičnim kardiolipinskim antigenom, čija se 1 kap pomiješa s 2-3 kapi proučavanog krvnog seruma u jažice posebne staklene ploče.Prednost- brzina dobivanja odgovora (za 30-40 minuta). Rezultati se vrednuju prema količini taloga i veličini pahuljica. Ozbiljnost je definirana kao CSR - 4+, 3+, 2+ i negativno. Valja napomenuti da se lažno pozitivni rezultati opažaju češće nego kod RV. Ekspresna metoda se u pravilu koristi za masovne preglede sifilisa, tijekom pregleda u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima, somatskim odjelima i bolnicama. Na temelju rezultata ekspresne metode zabranjena je dijagnoza sifilisa, isključena je njegova uporaba kod trudnica, donatora, a također i za kontrolu nakon liječenja.
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)
Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (RIBT)- predložili su 1949. R.W.Nelson i M.Mayer. To je najspecifičnija dijagnostička pretraga za sifilis. Međutim, složenost i visoka cijena postavljanja ograničava njegovu primjenu. U krvnom serumu pacijenata određuju se video-specifična antitijela (imobilizini), koja dovode do nepokretnosti blijedih treponema u prisutnosti komplementa. Antigen je živa patogena treponema pallidum izolirana iz kunića zaraženih sifilisom. Uz pomoć mikroskopa broji se broj imobiliziranih (imobiliziranih) blijedih treponema i ocjenjuju se rezultati RIBT: imobilizacija blijedih treponema od 51 do 100% je pozitivna; od 31 do 50% - slabo pozitivno; od 21 do 30% - sumnjivo; od 0 do 20% - negativno.RIBT je važno kada diferencijalna dijagnoza razlikovati lažno pozitivne serološke reakcije od reakcija uzrokovanih sifilisom. Postaje pozitivan kasnije od RV, RIF i stoga za dijagnostiku različite forme sifilis se ne koristi, iako je u sekundarnom razdoblju sifilisa pozitivan u 85-100% bolesnika.
U tercijarnom razdoblju sifilisa s oštećenjem unutarnjih organa, mišićno-koštanog sustava i živčanog sustava, RIBT je pozitivan u 98-100% slučajeva ( RV je često negativan).
Treba imati na umu da RIBT može biti lažno pozitivan ako su u ispitivanom serumu prisutni treponemocidni lijekovi (penicilin, tetraciklin, makroliti itd.), koji uzrokuju nespecifičnu imobilizaciju blijedog treponema. U tu svrhu, krv za RIBT ispituje se najranije 2 tjedna nakon završetka uzimanja antibiotika i drugih lijekova.
RIBT, kao i RIF, polako je negativan tijekom liječenja, pa se ne koristi kao kontrola tijekom liječenja.
Reakcija imunofluorescencije (RIF)
Reakcija imunofluorescencije (RIF)- razvio ga je 1954. A. Coons, a prvi su ga koristili za dijagnosticiranje sifilitične infekcije Deacon, Falcone, Harris 1957. RIF se temelji na neizravnoj metodi za određivanje fluorescentnih protutijela. Antigen za određivanje stadija su tkivno patogene blijede treponeme fiksirane na stakalce, na koje se nanosi ispitivani serum. Ako se u testiranom serumu nalaze antitreponemska protutijela koja se odnose na IgM i IgG, ona se snažno vežu za antigen - treponemu, što se detektira pod fluorescentnim mikroskopom pomoću antispecialnog ("antihumanog") fluorescentnog seruma.Rezultati RIF-a uzimaju se u obzir intenzitetom sjaja blijede treponeme u preparatu (žuto-zeleni sjaj). U nedostatku anti-treponemalnih protutijela u serumu, blijede treponeme se ne otkrivaju. U prisutnosti protutijela otkriva se sjaj blijede treponeme, čiji se stupanj izražava u plusevima: 0 i 1+ - povratni udar; od 2+ do 4+ - pozitivno.
RIF se odnosi na grupne treponemske reakcije i stavlja se u razrjeđenje ispitivanog seruma 10 i 200 puta (RIF-10 i RIF-200). RIF-10 se smatra osjetljivijim, ali nespecifični pozitivni rezultati često ispadnu nego kod RIF-200 (ima veću specifičnost). Obično, RIF postaje pozitivan prije nego RW- pozitivan kod primarnog seronegativnog sifilisa u 80% bolesnika, kod 100% u sekundarnom razdoblju sifilisa, uvijek pozitivan kod latentnog sifilisa i u 95-100% slučajeva kod kasnih oblika i kongenitalnog sifilisa.
RIF specifičnost povećava se nakon predtretmana ispitivanog seruma sorbentom-ultrazvučnim treponemskim antigenom koji veže grupna antitijela (RIF - abs).
Indikacije za postavljanje RIBT i RIF- dijagnoza latentnog sifilisa za potvrdu specifičnosti kompleksa lipidnih reakcija u slučaju sifilitičke infekcije na temelju pozitivnog RV. Pozitivni RIBT i RIF dokaz su latentnog sifilisa. S lažno pozitivnim RV razne bolesti(sistemski lupus eritematozus, maligne neoplazme itd.), a ako su ponovljeni rezultati RIBT i RIF negativni, to ukazuje na nespecifičnu prirodu RV. Sumnja na kasne sifilitičke lezije unutarnjih organa, mišićno-koštanog sustava, živčanog sustava u prisutnosti negativnog RV u bolesnika. Sumnja na primarni seronegativni sifilis, kada se u bolesnika s ponovljenim studijama iscjetka s površine erozije (čir), s punkcijom iz povećanih regionalnih limfnih čvorova, ne otkrije blijeda treponema - u ovom slučaju postavlja se samo RIF - 10.
Prilikom pregleda osoba s negativnim RV koji su imali dugotrajne seksualne i kućne kontakte s pacijentima sa sifilisom, s obzirom na vjerojatnu mogućnost liječenja u nedavnoj prošlosti antisifilitičkim lijekovima koji su uzrokovali RV negativan. Imunoenzimski test (ELISA, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - metodu su razvili E.Engvall i sur., S.Avrames (1971). Suština se sastoji u kombinaciji sifilitičkog antigena adsorbiranog na površini čvrste faze nosača s antitijelom proučavanog krvnog seruma i detekcije specifičnog kompleksa antigen-antitijelo pomoću enzimski označenog anti-species imunološkog krvnog seruma. To vam omogućuje da vizualno procijenite rezultate ELISA-e prema stupnju promjene boje supstrata pod djelovanjem enzima koji je dio konjugata. Nepouzdani rezultati ELISA mogu se pojaviti kao posljedica nedovoljnog razrjeđivanja sastojaka, kršenja temperaturnih i vremenskih režima, nedosljednosti pH otopina, kontaminacije laboratorijskog staklenog posuđa i nepravilne tehnike pranja nosača.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA)
Predložen kao dijagnostički test za sifilis T. Rathlev (1965.1967), T. Tomizawa (1966). Makromodifikacija reakcije naziva se TRHA, mikromodifikacija je MHA-TR, automatizirana verzija je AMNA-TR, reakcija s poliurea makrokapsulama umjesto eritrocita je MSA-TR. Osjetljivost i specifičnost RPHA slične su RIBT, RIF, ali je RPHA manje osjetljiv u ranim oblicima sifilisa u usporedbi s RIF-abs i osjetljiviji u kasnim oblicima, s kongenitalnim sifilisom. RPGA se postavlja u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji.Tehnika uzimanja krvi za serološke reakcije
Za istraživanje RV, RIF, RIBT, krv se uzima iz kubitalne vene natašte ili ne prije 4 sata nakon obroka sterilnom štrcaljkom ili jednom iglom (gravitacijom). Na mjestu uzimanja uzoraka koža se prethodno tretira 70% alkoholom. Štrcaljku i iglu treba isprati izotoničnom otopinom natrijevog klorida. U čistu, suhu i hladnu epruvetu ulije se 5-7 ml ispitivane krvi. Na epruvetu se lijepi prazan papir s prezimenom bolesnika, inicijalima, brojem povijesti bolesti ili ambulantnog kartona, datumom vađenja krvi. Nakon vađenja krvi epruveta se stavlja u hladnjak sa temperaturni režim+4°+8°S do sljedećeg dana. Sljedećeg dana, serum se isušuje za istraživanje. Ako se krv ne koristi sljedeći dan, serum se mora iscijediti iz ugruška i čuvati u hladnjaku ne duže od 1 tjedna. Za istraživanje na RIBT epruveta mora biti posebno pripremljena i sterilna. U slučaju kršenja pravila uzimanja krvi za istraživanje, nepoštivanje uvjeta može dovesti do izobličenja rezultata.Ne preporučuje se uzimanje krvi za istraživanje nakon jela, alkohola, raznih lijekovi, nakon uvođenja raznih cjepiva, tijekom menstrualnog ciklusa među ženama.
Za istraživanje ekspresnom metodom krv je uzeta iz vrha prsta, kao što se radi kada se uzima za ESR, ali krv se uzima za 1 kapilaru više. Ekspresna metoda može se provesti i s krvnim serumom dobivenim venepunkcijom. Ako postoji potreba za krvnim pretragama u udaljenim laboratorijima, umjesto krvi može se poslati suhi serum (metoda suhe kapi). Da biste to učinili, sljedeći dan nakon uzimanja krvi, serum se odvoji od ugruška i uvuče u sterilnu štrcaljku u količini od 1 ml. Zatim se serum izlije u obliku 2 odvojena kruga na traku debljeg pisaćeg papira (voštanog papira ili celofana) veličine 6x8 cm, a na slobodnom rubu ispisuje se prezime, inicijali ispitanika i datum vađenja krvi. papir. Serum papir se zaštiti od izravnog sunčevog svjetla i ostavi na sobnoj temperaturi do sljedećeg dana. Serum se suši u obliku malih krugova sjajnog žućkastog staklastog filma. Nakon toga se papirnate trake s osušenim serumom smotaju poput farmaceutskog praha i šalju u laboratorij s naznakom dijagnoze i za koju svrhu se proučava.
Serološka rezistencija
U dijelu (2% ili više) bolesnika sa sifilisom, unatoč potpunoj antisifilitičkoj terapiji, dolazi do usporavanja (odsutnosti) negativnih seroloških reakcija nakon završetka liječenja do 12 mjeseci ili više. Postoji takozvana serološka rezistencija, koja se posljednjih godina sve više uočava. Postoje oblici serološke rezistencije:- Pravi(apsolutno, bezuvjetno) - potrebno je provesti dodatno antisifilično liječenje, u kombinaciji s nespecifičnom terapijom za povećanje imunoloških snaga tijela.
- Relativni- nakon potpunog liječenja, blijede treponeme stvaraju ciste ili L-forme, koje su u tijelu u nisko virulentnom stanju i, kao rezultat, dodatni tretman ne mijenja pokazatelje seroloških reakcija, osobito RIF i RIBT.
Pseudo-otpor- nakon tretmana, unatoč pozitivnim serološkim reakcijama, u tijelu nema blijede treponeme. U tijelu nema antigena, ali se nastavlja proizvodnja antitijela koja se fiksiraju prilikom postavljanja seroloških reakcija.
Serološka rezistencija može se razviti zbog:
- neadekvatno liječenje bez uzimanja u obzir trajanja i stadija bolesti;
- nedovoljna doza, a posebno zbog neuzimanja u obzir tjelesne težine pacijenata;
- kršenja intervala između uvođenja lijekova;
- očuvanje blijedih treponema u tijelu unatoč punopravnom specifično liječenje, zbog njihove otpornosti na penicilin i druge kemoterapijske lijekove u prisutnosti skrivenih, encistiranih lezija u unutarnjim organima, živčanom sustavu, limfni čvorovi, koji su nedostupni antibakterijski lijekovi(često se blijede treponeme nalaze u tkivima ožiljka mnogo godina nakon završetka terapije, u limfnim čvorovima ponekad je moguće otkriti blijede treponeme 3-5 godina nakon antisifilitičke terapije);
- smanjenje zaštitnih snaga kod raznih bolesti i intoksikacija (endokrinopatija, alkoholizam, ovisnost o drogama, itd.);
- opća iscrpljenost (prehrana siromašna vitaminima, bjelančevinama, mastima).
- prateći nespecifične bolesti unutarnji organi, poremećaji kardiovaskularnog sustava, reumatizam, disfunkcije endokrinog i živčanog sustava, teške kronične dermatoze, maligne neoplazme;
- lezije živčanog sustava (teške ozljede, potres mozga, mentalna trauma);
- trudnoća kronične intoksikacije alkohol, nikotinski lijekovi; zarazne bolesti (malarija, tuberkuloza, virusni hepatitis, dizenterija, tifus, trbušni tifus i povratna groznica).
Laboratorijska dijagnostika koristi nekoliko testova za sifilis odjednom kako bi dobio najtočniji rezultat. Ovo traje duže, ali daje najtočniji odgovor.
Najčešće se rezultat RIF analize prikazuje u brojkama. Dešifriranje ima sljedeće oznake:
- oštar pozitivan rezultat označeno sa 4 plusa (++++);
- pozitivan rezultat označen je s 3 plusa (+++);
- slabo pozitivan rezultat 2 plusa (++);
- dvojben rezultat 1 plus (+);
- negativan rezultat je označen sa 1 minus (-).
Rezultat RIF-a za sifilis također je prikazan kao postotak, što ovisi o kvantitativnom pokazatelju povezanih bakterija:
- s negativnim rezultatom, imobilizacija do 20%;
- s slabo pozitivnim rezultatom, imobilizacija varira od 20 do 50%;
- kod pozitivnog rezultata imobilizacija je iznad 50%.
Ako je rezultat pozitivan odgovor, navodi prisutnost bolesti.
Ako rezultat slabo pozitivan, to ukazuje na jednu količinu rezidualnih antitijela u krvi.
Negativan rezultat ukazuje na odsutnost blijede treponeme, što znači da je pacijent zdrav.
Iskusni liječnici naše klinike brzo će dijagnosticirati sifilis uz visoku točnost očitanja. Socijalno smo orijentirani na sve segmente stanovništva, dakle trošak RIF analize je jeftin. Cijena je prikazana u tablici na našoj web stranici.
U serološkoj dijagnostici sifilisa vrlo je važno dobiti pouzdan i točan rezultat.
Poduzimaju se određene radnje za poboljšanje kvalitete podataka:
- Testni serum se razrijedi 200 puta (1:200) kako bi se izbjegle lažno pozitivne reakcije. Onda kažu da je u tijeku Analiza na sifilis RIF 200.
- U drugoj verziji, kada se serum razrijedi 1: 5, dodatno se koristi poseban upijač, koji skuplja "dodatna" antitijela na sebe tako da ne iskrivljuju rezultate.
Veličine treponema također igraju na ruku istraživačima. Velika mikrobna tijela spiroheta jasno su vidljiva pod fluorescentnim mikroskopom. Ako su "prikačeni" na fosforom obilježene proteine iz seruma. Korištenje standardiziranog antigena i seruma omogućuje maksimiziranje osjetljivosti i specifičnosti RIF-a u dijagnozi sifilisa.
Mogućnosti privatne analize RIF: RIF apsorpcija
Jedan od alternativni načini pod nazivom RIF-Abs. Od uobičajene tehnike razlikuje se niskim razrjeđenjem proučavanog seruma - 1:5 u odnosu na 1:200, kao i obično.
Koncentrirani uzorak sadrži mnogo aktivnih proteinskih molekula.
Kako bi se izbjegla i povećala osjetljivost, serum se tretira posebnim apsorbentom iz fragmenata sifilitičkih spiroheta. Sorbent skuplja prekomjerno aktivna antitijela na sebe, a zatim se uzorak tretira industrijskim, fosforom obilježenim serumom. Zahvaljujući ovoj preliminarnoj pripremi, eliminiraju se sve nepotrebne molekule koje bi mogle utjecati na rezultate testa.
Stavljaju ga prema sljedećim indikacijama:
- Pozitivno na pozadini kliničkog blagostanja i odsutnosti rizika od infekcije u povijesti.
- Pozitivan RV u bolesnika s kroničnim bolestima.
- Negativan RV kada se pojave simptomi sumnjivi na sifilis.
Prvi pozitivni rezultati pojavljuju se već 15-16 dana nakon infekcije. Ako pozitivna reakcija postane negativna, to je znak potpunog izlječenja od sifilisa. Vjerojatnost lažno pozitivnog rezultata manja je od 0,4%.
Ova situacija se može dogoditi kod pregleda bolesnika s rakom, alkoholičara, trudnica i osoba s imunološkim poremećajima.
Određeni udio otpada na tehničke greške, jer je izrada dosta komplicirana. Postoje slučajevi kada je potrebno razlikovati kongenitalnu patologiju od stečene. To možete učiniti ako tražite različiti tipovi protutijela u krvi bolesnika.
Protutijela klase M (IgM) protiv sifilisa pojavljuju se ubrzo nakon infekcije i puno su brža od IgG. Omogućuje vam da ih identificirate analiza za sifilis RIF apsorpcija IgM. Ako su rezultati ove reakcije pozitivni, tada možemo govoriti o nedavnoj infekciji. Tako se slučajevi ponovne infekcije mogu razlikovati od recidiva ili se može otkriti infekcija djeteta nakon poroda.
Na temelju rezultata ove metode RIF analize također zaključuju da je liječenje ranog sifilisa učinkovito.
Ako sumnjate na sifilis, obratite se iskusnom venerologu.
Sifilis je praćen brojnim simptomima i ima veliki broj klinički oblici. Njegovo prepoznavanje temelji se na opsežnom kliničkom i laboratorijskom pregledu bolesnika. Opća analiza krv za sifilis nosi malo informacija, stoga se ne koristi za dijagnosticiranje bolesti.
Za analizu se mogu uzeti sljedeći materijali:
- krv iz prsta i vene;
- liker - cerebrospinalna tekućina;
- odvojivi tvrdi šankr (čir);
- područja regionalnih limfnih čvorova.
Izbor materijala i dijagnostičke metode ovisi o stadiju bolesti. O tome koji se testovi daju za sifilis govorit ćemo u sljedećem odjeljku.
Klasifikacija metoda za laboratorijsku dijagnostiku bolesti
U početnoj fazi možete koristiti bakterioskopsku metodu, temeljenu na određivanju patogena - blijede treponeme - pod mikroskopom. U budućnosti se široko koriste serološki testovi koji se temelje na određivanju mikrobnih antigena i antitijela koje tijelo proizvodi u biološkom materijalu.
Bakteriološka istraživanja se ne provode, jer uzročnik sifilisa vrlo slabo raste na hranjivim medijima u umjetnim uvjetima.
Sve metode za otkrivanje treponema, odnosno vrste testova za sifilis, podijeljene su u dvije velike skupine:
1. Izravni, koji izravno otkrivaju sam mikrob:
- mikroskopija tamnog polja (otkrivanje treponema na tamnoj pozadini);
- RIT-test - infekcija kunića ispitivanim materijalom;
- polimeraza lančana reakcija(PCR) koji otkriva dijelove genetskog materijala mikroorganizma.
2. Neizravni (serološki), koji se temelji na otkrivanju protutijela na mikrob, koje tijelo proizvodi kao odgovor na infekciju.
Serološke pretrage dijele se u dvije skupine
Netreponemalni:
- reakcija vezanja komplementa s kardiolipinskim antigenom (RSKk);
- reakcija mikroprecipitacije (RMP);
- brzi plazma reagin test (RPR);
- test s toluidin crvenilom.
Treponemalni:
- reakcija fiksacije komplementa s treponemskim antigenom (RSKt);
- reakcija imobilizacije treponema (RIT ili RIBT);
- reakcija imunofluorescencije (RIF);
- reakcija pasivna hemaglutinacija(RPGA);
- enzimski imunološki test (ELISA);
- imunobloting.
Metode ovih analiza su prilično složene, pa ćemo se fokusirati uglavnom na to kada se provode i koliko točne informacije daju.
Recimo odmah da je osnova za dijagnosticiranje sifilisa serološke metode. Kako se zove test za sifilis: u svakom slučaju pregled može uključivati različite tehnike. U nastavku ćemo ih detaljnije opisati.
Izravni testovi
Njihovo otkrivanje pod mikroskopom uvjerljivo dokazuje prisutnost treponema. Vjerojatnost sifilisa u ovom slučaju doseže 97%. Međutim, mikrobi se mogu otkriti samo u 8 pacijenata od 10, tako da negativan test ne isključuje bolest.
Dijagnostika se provodi u razdobljima kada postoji tvrdi šankr ili kožni osip. U ispuštanju ovih zaraznih elemenata traže se uzročnici bolesti.
Učinkovitiji, ali i skuplji i složena analiza– otkrivanje treponema nakon njihovog prethodnog tretmana fluorescentnim antitijelima. To su tvari koje se “lijepe” na mikrobe i stvaraju njihov “sjaj” u polju mikroskopa.
Osjetljivost metoda se smanjuje s dugim trajanjem bolesti, liječenjem čireva i osipa antisepticima, kao i nakon liječenja.
Biološka metoda za dijagnosticiranje RIT-a je vrlo specifična, ali skupa, a rezultat se dobiva samo putem dugo vremena kada zaražena životinja razvije bolest. Trenutno se metoda praktički ne koristi, iako je praktički najtočnija od svih. Izvrstan krvni test za sifilis za otkrivanje genetskog materijala treponema - PCR. Njegovo jedino ograničenje je relativno visoka cijena dijagnostike.
Serološke metode
Netreponemski testovi
RSKk i RMP
Najpoznatiji od ovih testova je Wassermanova reakcija. Ovo je put brza dijagnoza(brza analiza na sifilis), koja se temelji na sličnoj reakciji antitijela iz krvi bolesne osobe na same treponeme i na kardiolipin dobiven iz goveđeg srca. Kao rezultat ove interakcije antitijela i kardiolipina nastaju ljuskice.
U Rusiji ovu analizu praktički se ne koristi. Zamijenjena je reakcijom mikrotaloženja. Nedostatak metode je niska specifičnost. Lažno pozitivna analiza krv za sifilis nalazi se kod tuberkuloze, bolesti krvi, sistemskog eritemskog lupusa, tijekom trudnoće, nakon rođenja djeteta, tijekom menstrualnog krvarenja iu mnogim drugim slučajevima. Stoga, s pozitivnim RW, više precizne metode dijagnostika.
Nakon infekcije, reakcija postaje pozitivna nakon dva mjeseca. Kod sekundarnog sifilisa pozitivan je u gotovo svih bolesnika.
Reakcija mikroprecipitacije, koja je zamijenila Wassermannovu reakciju, ima sličan mehanizam. Jeftin je, jednostavan za izvođenje, brz za procjenu, ali također može dati lažno pozitivan rezultat. Ova dva testa koriste se kao testovi probira.
RMP postaje pozitivan mjesec dana nakon pojave tvrdog šankra. Za njegovu provedbu koristi se krv iz prsta.
Može li test na sifilis biti pogrešan? Svakako da, pogotovo kada se koriste netreponemski testovi.
Uzroci akutnih lažno pozitivnih testova pri korištenju RMP-a:
- akutne zarazne bolesti;
- upala pluća;
- infarkt miokarda;
- moždani udar;
- ozljede i trovanja.
Kronični lažno pozitivni rezultati često se javljaju kod sljedećih bolesti:
- tuberkuloza;
- bruceloza;
- leptospiroza;
- sarkoidoza;
- reumatske bolesti;
- Infektivna mononukleoza;
- maligni tumori;
- dijabetes;
- ciroza jetre i drugi.
Ako postoje kontroverzne analize, za razjašnjenje dijagnoze koriste se treponemski serološki testovi.
RPR i test toluidin crvenila
Brzi plazma reagin test (rpr sifilis test) je još jedan tip reakcije s kardiolipinskim antigenom. Koristi se u sljedećim slučajevima:
- probir stanovništva;
- sumnja na sifilis;
- probir donora.
Spomenimo i test s toluidin crvenilom. Sve ove metode koriste se za procjenu učinkovitosti liječenja. Oni su polukvantitativni, odnosno smanjuju se s oporavkom, a povećavaju s ponavljanjem infekcije.
Negativni rezultati netreponemskih testova najvjerojatnije ukazuju na to da ispitanik nema sifilis. Stoga se za procjenu izlječenja koriste netreponemski testovi. Prvu takvu analizu treba uzeti 3 mjeseca nakon završetka tijeka liječenja.
Treponemski testovi
Treponemski testovi temelje se na upotrebi treponemskih antigena, što značajno povećava njihovu dijagnostičku vrijednost. Primjenjuju se u sljedećim situacijama:
- pozitivan test probira (reakcija mikroprecipitacije);
- prepoznavanje lažno pozitivnog rezultata probira;
- sumnja na sifilis;
- dijagnostika latentnih oblika;
- retrospektivna dijagnoza kada je pacijent ranije imao bolest.
RIT i RIF
Najkvalitetniji (visoko osjetljivi i visoko specifični) su RIT i RIF. Nedostaci ovih metoda su složenost, dugotrajnost, potreba za suvremenom opremom i educiranim osobljem. Kod većine izliječenih bolesnika treponemski testovi ostaju pozitivni dugi niz godina i stoga se ne mogu koristiti kao kriterij izlječenja.
RIF postaje pozitivan dva mjeseca nakon infekcije. Ako je negativan, pacijent je zdrav, ako je pozitivan, vjerojatnost bolesti je velika.
RIT se posebno često koristi u bolesnika s pozitivnim karcinomom mokraćnog mjehura kako bi se isključila ili potvrdila bolest. Vrlo je osjetljiv i omogućuje vam da s velikom točnošću odredite ima li pacijent sifilis ili ne. Međutim, analiza postaje pozitivna tek tri mjeseca nakon infekcije.
Imunobloting
Imunobloting je još osjetljiviji od RIF-a, ali manje osjetljiv od RPHA. Koristi se rijetko, uglavnom za dijagnozu neonatalnog sifilisa.
Navedene metode nisu prikladne za probir, odnosno brzo otkrivanje bolesti, jer postaju pozitivne kasnije od reakcije mikroprecipitacije.
ELISA i RPHA
Moderne visoko informativne standardizirane metode za dijagnosticiranje sifilisa - ELISA i RPHA. Oni su jeftini, brzo se postavljaju i testiraju u velikim količinama. Ovi se testovi mogu koristiti za potvrdu dijagnoze.
Analiza RPHA postaje pozitivna s primarnim seropozitivnim sifilisom, odnosno s pojavom tvrdog šankra (mjesec dana nakon infekcije). Posebno je vrijedan u dijagnozi kasnog, i kongenitalni oblici bolesti. Međutim, RPHA treba nadopuniti s najmanje jednim netreponemskim i jednim treponemskim testom za točnu dijagnozu. Takav trostruki test je najpouzdanija analiza za sifilis. Nedostatak RPGA je očuvanje pozitivna reakcija dugo vremena, što ne dopušta da se test koristi kao kriterij za izlječenje.
ELISA test na sifilis postaje pozitivan već tri tjedna nakon bolesti. Nedostatak ELISA testa je što može biti lažan. Lažno pozitivna reakcija javlja se kada sistemske bolesti, metabolički poremećaji, kao i kod djece rođene od bolesnih majki.
Mane serološke metode dovela je do razvoja najnaprednijih metoda koje ne daju pogreške, ali su zasad skupe i rijetko se koriste – plinska kromatografija i masena spektrometrija.
Algoritam za dijagnosticiranje sifilitičke infekcije u različitim fazama
U primarnom seronegativnom razdoblju (do 2 mjeseca nakon infekcije) traži se treponema u tamnom polju ili pomoću fluorescentnih protutijela.
Kod primarnog seropozitivnog, sekundarnog i latentnog sifilisa koriste se RMP i ELISA, a RPHA kao potvrdni test.
U bolesnika s recidivima sekundarnog sifilisa pregledavaju se elementi osipa, pokušavajući izolirati treponemu od njih za mikroskopski pregled.
U tercijarnom razdoblju RMP je u trećine bolesnika negativan. ELISA i RPHA su pozitivni, ali ne moraju ukazivati na tercijarni sifilis, već na prethodnu bolest. Slabo pozitivna analiza vjerojatnije ukazuje na oporavak od tercijarnog sifilisa.
Prilikom postavljanja dijagnoze "kongenitalnog sifilisa" uzima se u obzir prisutnost bolesti kod majke, razlika u stopama RMP u majke i djeteta, pozitivni ELISA i RPHA u novorođenčeta i imunobloting.
Trudnice moraju biti pregledane na sifilis, posebno one koje su već imale porođaj s mrtvim plodom, trudnoću koja se ne razvija, rane pobačaje. Oni provode RMP, ELISA, RPGA. Ispitajte prisutnost bolesti i prije prekida trudnoće.
Pravila za dobivanje analize za sifilis
Da biste dobili uputnicu za laboratorij, morate posjetiti svog okružnog liječnika. Ako želite brže napraviti test, to možete učiniti u privatnom laboratoriju bez uputnice (npr. Invitro laboratoriji brzo i anonimno rade analizu na sifilis).
Kako se testirati na sifilis? Krv se daje ujutro, natašte. Možete piti samo čistu vodu.
priprema: dva dana prije testa, iz prehrane treba isključiti masnu hranu, a posebno alkohol.
Kako se uzima analiza? na uobičajeni način iz prsta ili kubitalne vene.
Koliko košta test na sifilis? Rezultat testa obično je spreman sljedeći dan. Prijepis se može uzeti kod liječnika ili u laboratoriju.
Koliko je analiza valjana? Do tri mjeseca.
Analiza cerebrospinalne tekućine
U nekim slučajevima, analiza CSF-a se uzima za dijagnosticiranje neurosifilisa.
Ovaj pregled je propisan za sve pacijente sa latentni sifilis ako imaju znakove patologije živčanog sustava, kao i s latentnim i kasnim neurosifilisom.
Osim toga, analiza se provodi kod svih pacijenata nakon oporavka, uz održavanje njihovih pozitivnih seroloških reakcija. Već smo napisali u našem članku da se ovaj fenomen događa prilično često.
Analizu likvora na sifilis propisuje i provodi samo liječnik.
Cerebrospinalna tekućina se dobiva punkcijom između dva kralješka lumbalni. Skuplja se po 4 ml u dvije epruvete. Zatim se mjesto uboda tretira jodom i prekrije sterilnim zavojem. Nakon punkcije bolesnik treba ležati na trbuhu s podignutim nožnim rubom kreveta najmanje 3-4 sata, a zatim može ležati na boku. Mirovanje nakon punkcije se pokazuje unutar dva dana.
Cerebrospinalna tekućina iz prve epruvete ispituje se općeprihvaćenim reakcijama na sadržaj bjelančevina, stanica i utvrđivanjem znakova meningitisa (upale moždanih ovojnica).
Cerebrospinalna tekućina iz druge epruvete ispituje se na sadržaj antitijela na treponemu pomoću Wassermanove reakcije, RMP, RIF i RIBT, o čemu smo gore govorili.
Prema težini kršenja, razlikuju se četiri vrste promjena u cerebrospinalnoj tekućini. Analizirajući ih, liječnik može zaključiti da postoje različiti oblici oštećenja živčanog sustava (vaskularni neurosifilis, sifilitički meningitis, meningovaskularni sifilis, dorzalni tabes, kasni mezenhimalni neurosifilis), kao i oporavak bolesnika s pozitivnim serološkim testovima.
veličina fonta
NAREDBA Ministarstva zdravstva SSSR-a od 02-09-85 1161 O POBOLJŠANJU SEROLOŠKE DIJAGNOSTIKE SIFILISA (zajedno s UPUTAMA ZA ... Relevantno u 2018.
Način podešavanja RIF - ABS
Ispitani krvni serum
Krv za dobivanje krvnog seruma uzima se iz kubitalne vene u čistu i suhu epruvetu u volumenu od 5 ml i obrađuje na isti način kao za postavljanje Wassermanove reakcije. Krvni se serum inaktivira jednokratno na temperaturi od 56° u trajanju od 30 minuta. S obzirom na to da se RIF-abs postavlja nesterilno, nije potrebna upotreba sterilnih posuda i pridržavanje uvjeta sterilnosti prilikom pohranjivanja krvnih seruma. Važno je samo za dulje čuvanje krvnih seruma prije studije.
Kao antigen koristi se suspenzija patogenih blijedih treponema soja Nichols iz orhitisa kunića starog 7 dana. Zdravi muški kunići s negativnim Wassermanovim i RIT nalazima inficiraju se intratestikularno, a kod pojave orhitisa uklanjaju se blijede treponeme iz testisa na isti način kao i kod dobivanja antigena za RIT. Dobivena suspenzija blijedih treponema izlije se iz komadića testisa u sterilne epruvete s vatom i ostavi jedan dan u hladnjaku na 4°, nakon čega se odvoji od taloga i čuva pod istim uvjetima za cijeli razdoblje korištenja.
Dobivanje i skladištenje antigena zahtijeva poštivanje uvjeta sterilnosti, tk. s istim antigenom, reakcija se može postaviti unutar 2-4 mjeseca. Za antigen treba odabrati suspenziju u kojoj nema aglutinacije treponema i ima ih u dovoljnoj količini. Antigen se može nabaviti u ampulama iz drugih laboratorija. Prije svake reakcije suspenzija se dobro promiješa i pregleda pod mikroskopom s kondenzatorom tamnog polja kako bi se odredila njezina gustoća. Za postavljanje RIF-abs potrebna je suspenzija koja sadrži 40-60 treponema u tamnom vidnom polju, a ako je prisutna gušća suspenzija potrebno ju je razrijediti.
Kao sorbent za RIF-abs može se koristiti ultrazvučni treponemski antigen za RSK, koji proizvodi Kaunas poduzeće za proizvodnju bakterijskih pripravaka Ministarstva zdravstva SSSR-a. To je suspenzija mješavine uzgojenih blijedih treponema sojeva V, VII, VIII, IX i Reitera uništenih ultrazvukom. Svaka serija sorbenata mora se titrirati prije upotrebe u RIF-abs u dijagnostičke svrhe.
Titracija sorbenata
Sorbenti se titriraju na krvnim serumima bolesnika sa sifilisom, dajući oštro (4+) i slabo (2+) pozitivan rezultat u RIF-u u razrjeđenju 1: 5, kao i na krvnim serumima osoba bez sifilisa. infekcije, dajući negativan rezultat u RIF-5 i nespecifičnu pozitivnost (2+ ili više).
Primjer određivanja titra sorbenta
Cijeli sorbent se razrijedi fosfatnim puferom, pH = 7,2, 2, 3, 4 puta ili više. Od pacijenata sa sifilisom uzimaju se 3 krvna seruma, od kojih jedan daje izrazito pozitivan (4+) rezultat RIF-5, 2 - slabo pozitivan (2+), te 5 krvnih seruma od osoba bez sifilitične infekcije, od kojih 3 daju nespecifične rezultate i RIF-5 (2+ i više). Svi se krvni serumi razrijede 5 puta sorbentom razrijeđenim 2, 3, 4 ili više puta fosfatnim puferom. Zatim se u reakciji ispituje krvni serum. Nakon uzimanja u obzir rezultata odabire se razrjeđenje sorbenta u kojem sorbirani krvni serumi bolesnika sa sifilisom zadržavaju stupanj pozitivnosti sličan onom dobivenom krvnim serumima razrijeđenim fosfatnim puferom, te krvnim serumima osoba bez sifilitička infekcija ne svijetle. Ovo razrjeđenje sorbenta je njegov titar.
Titar sorbenta u ovom slučaju bio je razrjeđenje od 1: 3, u kojem su svi krvni serumi bolesnika sa sifilisom zadržali stupanj pozitivnosti dobiven u kontroli, au isto vrijeme nespecifičnu pozitivnost nesifilitične krvi. seruma je pouzdano uklonjen.
Anti-species luminiscentni serum
Fluorokromom obilježeni krvni serum životinja imuniziranih proteinima iz ljudskog seruma potreban je za proučavanje seruma ljudske krvi u RIF-abs. Liofilizirani luminiscentni serum otopi se u sterilnim uvjetima u destiliranoj vodi u volumenu naznačenom na naljepnici ampula, ulije u sterilnu epruvetu s gumenim čepom i tijekom upotrebe čuva na 4°C 1-2 mjeseca.
Na dan reakcije potrebna količina ovog seruma se prema titru razrijedi destiliranom vodom. Radno razrjeđenje seruma navedeno na naljepnici nije prikladno za postavljanje reakcije u svrhu serodijagnostike sifilisa, pa se titar svake serije mora ponovno odrediti.
Tablica br. 13
Rezultati titracije sorbenta
| Testirani krvni serumi | Rezultati RIF-5 | |||
| Razrjeđivanje krvnog seruma 1:5 pufer (K) | Razrjeđivanje krvnog seruma 1: 5 sorbent u razrjeđenju | |||
| 1: 2 | 1: 3 | 1: 4 | ||
| Krvni serum bolesnika sa sifilisom | ||||
| N 1 | 4+ | 3+ | 4+ | 4+ |
| N 2 | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ |
| N 3 | 2+ | 2+ | 2+ | |
| Nesifilični krvni serum | ||||
| N 1 | 3+ | 1+ | 2+ | |
| N 2 | 2/3+ | 2+ | ||
| N 3 | 2+ | 2+ | ||
| N 4 | 2+ | 2+ | ||
| N 5 | ||||
Titracija luminiscentnog seruma protiv vrste
Uzimaju 5 krvnih seruma bolesnika sa sifilisom i 5 krvnih seruma zdravih ljudi, razrjeđuju ih 5 puta sorbentom (uzimajući u obzir njegov titar) i reagiraju različitim razrjeđenjima luminiscentnog seruma u fazi II protiv humanih serumskih globulina serije čiji određuje se titar. Treba uzeti u obzir da je titar luminiscentnih seruma koji trenutno proizvodi IEM. N.F. Gamalei, varira kada je RIF-abs postavljen od 1: 100 do 1: 140. Uzimajući u obzir reakciju, treba uzeti u obzir preliminarni titar luminescentnog seruma da razrjeđenje, kada se koristi s pozitivnim krvnim serumima, daje dobar sjaj treponema dobiven, a s negativnim sjajem antigena nije primljen. Veće razrjeđenje luminiscentnog seruma od titra dovodi do smanjenja osjetljivosti reakcije, a manje do smanjenja specifičnosti. Nakon određivanja preliminarnog titra, potrebno ga je pročistiti više pozitivni i negativni krvni serumi. Konačnim titrom može se smatrati onaj koji se ispituje na 100 krvnih seruma, od kojih najmanje 20 treba biti od bolesnika sa sifilisom.
Da bi se spriječilo klijanje nakon razrjeđivanja suhog luminiscentnog seruma destiliranom vodom, potrebno mu je dodati mortiolat u omjeru 1 volumena njegove otopine 1: 1000 na 9 volumena luminiscentnog seruma. Kod uzimanja novih ampula iste serije, titar treba provjeriti i razjasniti samo za 10 poznatih pozitivnih i negativnih krvnih seruma.
Primjer određivanja preliminarnog titra luminescentnog antispecies seruma
Pripremite 60 lijekova, označite ih brojevima od 1 do 60. Uzmite 10 krvnih seruma - 5 od pacijenata sa sifilisom, 5 od zdravih ljudi. Svi se krvni serumi razrijede 5 puta razrijeđenim ali titarskim sorbentom.
Na brojevima 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 lijekovi se primjenjuju u prvoj fazi reakcije s istim 10 krvnim serumima, razrijeđenim 5 puta sorbentom. U II fazi reakcije nanosi se luminiscentni serum razrijeđen 1:100 na 1-10 preparata, 1:110 na 11-20, 1:120 na 21-30, 1:130 na 31-40, 1:130 na 41-50 : 140, na 51-60 - 1 : 150.
RIF-aps tehnika postavljanja
Preparati se pripremaju od antigena na tankim, dobro odmašćenim stakalcima, na obrnuta strana koji se kružićima promjera 0,7 cm označavaju staklorezačem (10 kružića na 1 predmetnom staklu). Unutar kruga na staklo se nanosi antigen-suspenzija blijedih treponema. Zatvoreni kraj Pasteurove pipete kružnim pokretima suspenzija se raspodijeli unutar kruga, suši na zraku i fiksira 10 minuta u kemijski čistom acetonu. Zatim se lijekovi numeriraju. Inaktivirani ispitivani krvni serumi razrijede se 5 puta sorbentom razrijeđenim u titru puferskom otopinom. U stalak se stavlja određeni broj epruveta čiji broj i broj odgovara broju i broju ispitivanih krvnih seruma. Sorbent razrijeđen titrom ulije se u epruvete pipetom u 0,2 ml, zatim se doda 0,05 ml cijelog ispitivanog krvnog seruma i dobro promiješa. Razrjeđivanje krvnog seruma može se provesti pomoću aparata Florinsky. Na antigen se nanese krvni serum razrijeđen sorbentom tako da ravnomjerno prekrije razmaz, a preparati se stave u vlažnu komoru koja se zatvori poklopcem i stavi u termostat na 37° na 30 minuta (I faza reakcije). ). Nakon prve faze preparati se pažljivo isperu u 2 obroka fosfatnog pufera, a preparati se stave u drugi dio na 10 minuta, osuše, nakon čega se ponovo stave u vlažnu komoru, aplicira se luminiscentni serum razrijeđen u titru. i ostavljena na sobnoj temperaturi 30 minuta (reakcije faze II). Na kraju druge faze, preparati se isperu fosfatnim puferom kao što je gore opisano, osuše i nanesu na površinu razmaza kap po kap neluminiscentnog imerzijskog ulja (dimetil ftalat).
Pregled preparata provodi se u fluorescentnom mikroskopu sa živinom kvarcnom žaruljom DRSh-250 s imerzionim sustavom, okularom 4X ili 5X, filterima SZS-7 ili 14, FS-1. BS-8 i ZhS-18 ili T-2N. Računovodstvo za reakciju provodi se procjenom sjaja blijede treponeme. U RIF-abs, krvni serumi se smatraju pozitivnim, koji daju sjaj na 4+, 3+ i 2+. Briljantan zeleno-žuti sjaj ocijenjen je 4+, svijetli - 3+, slab sjaj 2+. Krvni serumi se smatraju negativnima ako daju sjaj 1+ (treponemi u preparatu su obojeni intenzivnije od pozadine) ili ga ne daju.
U svakoj formulaciji RIF-abs moraju se koristiti sljedeće kontrole:
Oštra pozitivna kontrola. Krvni serum pacijenta sa sifilisom, daje sjaj 4+ kada se razrijedi puferom 5 puta. Kada se razrijedi 5 puta sorbentom, krvni serum ne smije izgubiti stupanj pozitivnosti za više od 1+.
Slaba pozitivna kontrola. Cijeli ili razrijeđeni krvni serum pacijenta sa sifilisom, daje slabi stupanj luminiscencije antigena od 2+ kada se razrijedi puferom 5 puta. Kada se razrijedi sorbentom, treba sačuvati njegovu pozitivnost.
nespecifična kontrola. Nesifilični krvni serum, koji razrijeđen puferom daje fluorescenciju od najmanje 2+. Kada se razrijedi sorbentom, njegova se pozitivnost mora eliminirati.
Kontrole antigena, sorbenta, luminiscentnog seruma mogu se postaviti samo kada se koriste nove serije ovih sastojaka.
Metoda postavljanja RIF-abs s kapilarnom krvlju
Postavljanje RIF-abs moguće je ne samo krvnim serumom, već i krvlju uzetom iz prsta. Ova modifikacija RIF-abs može se koristiti pri ispitivanju djece na sifilis, kada je teško dobiti krv iz vene kod odraslih i pri masovnom pregledu različitih kontingenata na sifilis.
Kod postavljanja RIF-abs s krvlju koriste se isti reakcijski sastojci kao i kod postavljanja RIF-abs s krvnim serumom (antigen, sorbent, luminiscentni serum). Titar luminiscentnog seruma određuje se prema gornjoj shemi, ali pri postavljanju reakcije s krvlju. Nakon punkcije pacijentovog prsta, krv za pretragu se uzima mikropipetom do oznake od 0,1 ml, brzo upuhuje u epruvetu s 0,3 ml destilirane vode, temeljito se miješa pipetom i filtrira kroz papirnati filtar navlažen destiliranom vodom . Postavljanje reakcije s razrijeđenom krvlju moguće je i na dan uzimanja i nakon 1-2 dana, pod uvjetom da se čuva na 4 °.
Neposredno prije postavljanja reakcije u sve uzorke krvi koji su uključeni u postavljanje reakcije doda se 0,1 ml cijelog sorbenta, pomiješa se pipetom i mućka i stavi u termostat na 37° 30 minuta. Zatim se krv tretirana sorbentom nanosi na razmaze antigena i stavlja u vlažnu komoru na 37° (1. faza reakcije). Nakon isteka vremena ekspozicije preparati se isperu u prvom dijelu fosfatnog pufera tako da na stakalcima ne ostanu tragovi krvi i stave se na 10 minuta u drugi dio pufera. Nakon sušenja razmaza provodi se druga faza reakcije. Istodobno se na pripravke nanosi luminiscentni serum protiv humanih globulina razrijeđen prema titru utvrđenom za ovu modifikaciju RIF-a. Stakalca u vlažnoj komori ponovno se stave u termostat na 37°.
Nakon 30 minuta, preparati su ponovno isprani u 2 dijela fosfatnog pufera 10 minuta, osušeni i montirani za fluorescentnu mikroskopiju. Proučavanje lijekova i bilježenje rezultata reakcije provodi se na isti način kao kod postavljanja RIF-abs s krvnim serumom.
Način postavljanja RIF-200
Način postavljanja RIF-abs i RIF-200 su bliski. Prilikom postavljanja RIF-200, obrada ispitivanih krvnih seruma, priprema antigena, priprema antispecijskog luminescentnog seruma i njegova titracija se provode na isti način kao i kod postavljanja RIF-abs. Treba samo uzeti u obzir da se titri luminiscentnog seruma koji se trenutno proizvodi u RIF-200 kreću od 1:20 do 1:50.
Tehnika postavljanja RIF-200
Ispitivani krvni serumi razrijede se 200 puta fosfatnim puferom. Da biste to učinili, 3 reda epruveta stavljaju se u stalak, čiji broj i numeracija u svakom redu odgovara broju i numeraciji testiranih krvnih seruma u radnom dnevniku. U prvi red se sipaju puni ispitni krvni serumi, u drugi red se sipa 0,45 ml pufera u epruvete, u treći red 0,95 ml pufera. U drugom redu priprema se 10-struko razrjeđenje krvnog seruma, za što se iz svake epruvete prvog reda posebnom graduiranom pipetom od 1 ml uzme 0,05 ml ispitivanog krvnog seruma i prenese u odgovarajuću epruvetu drugog reda. reda i pomiješan s tamo dostupnim puferom. Iz svake epruvete drugog reda istom se pipetom prenese 0,05 ml ispitivanog krvnog seruma razrijeđenog 10 puta u odgovarajuću epruvetu trećeg reda i dobije se razrjeđenje od 200 puta.
Pri postavljanju reakcije na pripravke stavljene u vlažnu komoru nanosi se ispitivani krvni serum razrijeđen 200 puta tako da njihov broj naveden na epruvetama odgovara brojevima na stakalcu. Nakon nanošenja na pripravke krvnog seruma, vlažna komora se stavi na 30 minuta u termostat s temperaturom od 37° (I faza reakcije). Zatim se preparati ispiraju 10 minuta u 2 dijela pufera i suše. Nakon toga se ponovno stavljaju u vlažnu komoru i na sve se nanosi luminiscentni serum razrijeđen u titru (II. faza reakcije). Druga faza se provodi 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega se preparati ispiraju 10 minuta, suše i montiraju za fluorescentnu mikroskopiju.
Računovodstvo za rezultate RIF-200 provodi se na isti način kao i RIF-abs.
U slučaju kada kliničare zanima titar fluorescentnih protutijela u krvnom serumu pacijenta, treba koristiti RIF-abs i RIF-200 sa serijskim razrjeđenjem testiranih krvnih seruma, a titar fluorescentnih protutijela treba smatrati najvećim razrjeđenjem krvni serum, koji ipak daje pozitivan rezultat reakcije. Uobičajeno je označiti titar kao broj koji karakterizira stupanj razrjeđenja testiranog krvnog seruma, na primjer, 5, 10, 20, 40 itd. (RIF-abs) ili 200, 400, 800 itd. (RIF-200).
Pri postavljanju obje modifikacije reakcije za razrjeđivanje ispitivanih krvnih seruma i za ispiranje preparata nakon faze I i II treba koristiti fosfatni pufer sljedećeg sastava: 1 l destilirane vode, 6,8 g natrijevog klorida, 1,48 g g disupstituiranog natrijevog fosfata, 0,43 g monosupstituiranog kalijevog fosfata (PH = 7,2). Pripremljena otopina se čuva na sobnoj temperaturi ne više od tjedan dana.
Zbog mogućnosti dobivanja negativnih rezultata u prisutnosti fluorescentnih protutijela, krv i krvni serum ne treba ispitivati u RIF-abs i RIF-200 tijekom liječenja bolesnika penicilinom.
Tehnika postavljanja RIF-c
Rana dijagnoza lezija živčanog sustava kod sifilisa je hitan problem u borbi protiv ove bolesti. S obzirom na to da je RIF-c osjetljiviji od svih drugih testova koji se koriste za likvornu dijagnostiku sifilisa, ova se modifikacija RIF-a može preporučiti za dijagnostiku sifilitičkih lezija središnjeg živčanog sustava kod svih oblika sifilisa.
Za staging RIF-c koristi se isti antigen, luminescentni serum, kao i za staging RIF-abs i RIF-200 s krvnim serumom. Slično je i određivanje fluorescentnih protutijela u likvoru i krvnom serumu te registracija reakcije.
Cerebrospinalna tekućina se uvodi u reakciju neaktivirana i intaktna. Prije postavljanja reakcije može se čuvati u odjeljku zamrzivača hladnjaka u epruvetama ispod gumenih čepova do 2 tjedna. Odmrzavanje se provodi na sobnoj temperaturi.
Tehnika postavljanja RIF-c
U fazi I reakcije na antigen se nanese 0,05 ml nerazrijeđenog ispitivanog likvora, preparati se stave u vlažnu komoru 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se isperu s fosfatnim puferom, pH = 7,2, 10 minuta, osuše. U fazi II na preparate se nanosi luminiscentni serum razrijeđen u titru, koji se titrira pri postavljanju reakcije s likvorom. Preparati se drže na sobnoj temperaturi 30 minuta u vlažnoj komori, operu, osuše, montiraju za fluorescentnu mikroskopiju.
Izvori grešaka
1. Nepoštivanje uvjeta za pripremu, skladištenje reagensa i postavljanje reakcije.
2. Niska kvaliteta luminiscentnog seruma i netočno određivanje njegovog titra.
3. Primjena ispitnog materijala ili luminescentnog seruma pri postavljanju reakcije ne na lijeku, već na drugoj strani stakalca.
4. Neispravna postavka osvjetljenja u fluorescentnom mikroskopu.
5. Loša kvaliteta antigena.
